صياغة وتميز الجسيمات النانوية الدهنية لتسليم الجينات باستخدام منصة خلط Microfluidic

يمكن استخدام هذا البروتوكول لإنتاج جسيمات نانوية دهون مغلفة بحمض النيوكليك مع قابلية عالية للاستنساخ والسرعة وأحجام منخفضة. يمكن ضبط معلمات التركيب لتحقيق التوزيع الحيوي المطلوب استنادا إلى التطبيق السريري. يسمح التصميم القياسي لخرطوشة الميكروفلويديك بتدفق صفيحة سريعة ودقيقة وخاضعة للرقابة أثناء الاختلاط.

الأسلوب قابل للتوسع ويولد جزيئات موحدة مغلفة للغاية. مع معظم منتجات العلاج الجيني المعتمدة تجاريا التي تعتمد على الأساليب الفيروسية ، يمكن أن يوفر هذا الإجراء نظرة ثاقبة على تسليم الجينات ، حيث يسمح نهجه غير الفيروسي بالتطبيقات التي يكون التسريب المتكرر ضروريا لها. ابدأ بإضافة الكمية المناسبة من كل محلول مخزون سائل إلى قارورة زجاجية ذات دوامة متقطعة.

كما هو مبين في الجدول، يليه إضافة 200 الإيثانول دليل إلى حجم النهائي من 533 ميكرولتر. ثم أضف الكمية المناسبة من مخزون مرنا وتمييع مع العازلة سيترات لتحقيق حجم النهائي من 1.5 ملليلتر في التركيز المطلوب. لتهيئة القنوات microfluidic، أدخل أولا المعلمة فتيلة في برنامج الصك على النحو المبين في الجدول.

بعد ذلك، افتح غطاء الجهاز وضع خرطوشة microfluidic في كتلة الدورية. تحميل ما لا يقل عن 500 ميكرولتر من الإيثانول في حقنة 1 ملليلتر، مع الحرص على أنه لا توجد فقاعات أو فجوات الهواء في طرف الحقنة وإدراج الحقنة في المدخل الأيمن للخرطوشة. قم بتحميل حقنة سعة 5 ملليلترات مع 1.5 ملليلتر من العازلة سيترات، مع الحرص على عدم وجود فقاعات الهواء أو الثغرات، وإدراج الحقنة في المدخل الأيسر للخرطوشة.

ضع أنبوبين مخروطيين 15 ملليلتر في حاملات القصاصات لتكون بمثابة حاويات نفايات وانقر فوق Go "لخلط الحلول. عندما يتوقف الصك فتيلة كما هو مبين من قبل الضوء الأزرق السفلي إيقاف، وفتح في وقت متأخر والتخلص بشكل صحيح من الأنابيب المخروطية والمحاقن. لتشكيل الجسيمات النانوية الدهنية، قم بتعيين معلمات التركيب المناسبة كما هو مبين في الجدول وحمل حقنة 1 ملليلتر بمزيج من الدهون تم إعداده مسبقا.

قم بإزالة أي فجوات هوائية أو فقاعات في طرف الحقنة وأدخل الحقنة في الجانب الأيمن من الخرطوشة. قم بتحميل محلول الحمض النووي المعد مسبقا في حقنة 3 ملليلتر ، مع الحرص على عدم وجود فقاعات أو فجوات في الهواء في طرف الحقنة ، وإدخال الحقنة في المدخل الأيسر للخرطوشة. ضع أنبوبا مخروطيا خاليا من RNAase 15 ملليلترا يحمل اسم العينة في مقطع الأنبوب الأيسر وضع مخروطي نفايات 15 ملليلتر في مقطع الأنبوب الأيمن.

إغلاق غطاء الصك وانقر فوق Go.The الدهون وحلول مرنا سوف تتدفق من خلال خرطوشة microfluidic وسيتم جمع محلول الجسيمات النانوية الدهون في الأنابيب مخروطية. احتفظ بالأنبوب المخروطي في نهاية عملية التركيب ، ثم قم بتخفيف الجسيمات النانوية الدهنية مع 5 ملليلتر من PBS وخزانة السلامة البيولوجية. لإجراء تبادل عازلة، أولا غسل مسبق 100 كيلودالتون المسام حجم مرشح الطرد المركزي الفائق مع 2 ملليلتر من برنامج تلفزيوني، الطرد المركزي، ومن ثم تفريغ برنامج تلفزيوني من المقصورة السفلية.

أضف الجسيمات النانوية الدهنية المخففة إلى المقصورة العلوية لمرشح الطرد المركزي الفائق الذي تم غسله مسبقا لثلاثة غسالات طرد مركزي ، مع التخلص من التدفق وإضافة 5 ملليلترات من PBS إلى فلتر الطرد المركزي الفائق بعد أول غسلين. بعد الغسيل الأخير ، قم بتسميد محلول الجسيمات النانوية الدهنية مقابل جدران فلتر الطرد المركزي الفائق عدة مرات لتقليل فقدان الجسيمات النانوية قبل نقل محلول الجسيمات النانوية إلى قارورة خالية من النيوكليز. ثم إضافة برنامج تلفزيوني لجلب تعليق الجسيمات النانوية إلى التركيز التجريبي المناسب وحجم حسب الضرورة.

لتقييم كفاءة تغليف الجسيمات النانوية الدهنية ، قم أولا بإعداد تخفيفات متسلسلة ذات شقين من محلول الحمض النووي العامل في PBS لتوليد منحنى قياسي ، بدءا من 500 نانوغرام لكل ملليلتر وجعل ما لا يقل عن خمسة تمييعات. بعد ذلك ، قم بإعداد تخفيف عينة الجسيمات النانوية في PBS لتحقيق تركيز نظري مناسب يقع حول نقطة الوسط للمنحنى القياسي. ثم إعداد كاشف الحمض النووي الريبي الأخضر ريبو للكشف عن وجود الحمض النووي الريبي داخل وخارج الجسيمات النانوية الدهنية عن طريق خلط الكميات المناسبة من كاشف الحمض النووي الريبي، تريتون X100 وبرنامج تلفزيوني.

ثم، للكشف عن وجود الحمض النووي الريبي خارج الجسيمات النانوية السائلة، مزيج الكميات المناسبة من الكواشف الحمض النووي الريبي وبرنامج تلفزيوني فقط. تحميل يكرر معيار الحمض النووي وحلول الجسيمات النانوية الدهون في لوحة البئر 96 الفلورية السوداء قادرة، ثم إضافة حجم متساو من كاشف الحمض النووي الريبي الكمي مع، ودون تريتون X100 إلى معيار وعينة يكرر. هز اللوحة في قارئ اللوحة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء للحصول على خلط شامل للعينات ، ثم قياس الفلورسينس على قارئ لوحة صغيرة على طول موجي مثير من 480 نانومتر وطول موجي للانبعاثات قدره 520 نانومتر.

لقياس حجم الهيدروديناميكية وتشتت البولي من الجسيمات النانوية الدهنية، تمييع أولا محلول الجسيمات النانوية 40 مرة في برنامج تلفزيوني وإضافة الحل إلى cuvette شبه صغيرة. تحميل cuvette على زيتايزر واختيار إجراء التشغيل القياسية لتعيين الصك لقياس الجسيمات النانوية وفقا للمواد، المشتتة، ودرجة الحرارة ونوع الخلية. ثم انقر فوق ابدأ"لقياس حجم الهيدروديناميكية وتشتت بولي من الجسيمات النانوية الدهنية.

لقياس إمكانات زيتا من الجسيمات النانوية الدهنية، تمييع محلول الجسيمات النانوية 40 مرة في المياه الخالية من النيوكليز وتحميل الحل في cuvette إلى خط التعبئة. قم بتحميل الكوفيت في محلل زيتا المحتمل ، مع الحرص على أن الأقطاب الكهربائية تتصل بالأداة ، وتعيين الأداة لقياس إمكانات زيتا وفقا للتركيبة المحددة للجسيمات النانوية الدهنية. ثم انقر فوق ابدأ"لقياس إمكانات الجسيمات النانوية الدهنية زيتا.

في هذا التحليل، تم تطوير دفعات متعددة من الجسيمات النانوية الدهنية بنفس تركيبة الدهون ونسبة الأمين إلى الفوسفات في أيام منفصلة لإثبات قابلية تكرار هذه التقنية. وكما لوحظ، أظهرت الدفعتان الأولى والكبدية توزيعات متداخلة الحجم مع تشتت مماثل للبولي، دون ملاحظة اختلافات كبيرة في الحجم أو كفاءة التغليف بين الدفعات. وعادة ما تؤدي التغيرات في بارامترات الصياغة إلى بعض الاختلافات الصغيرة والهانة إحصائيا.

على سبيل المثال، يؤدي خفض نسبة الأمين إلى الفوسفات إلى انخفاض بنسبة 4٪ في كفاءة التغليف، مع زيادة مصاحبة في القطر الهيدروديناميكي للجسيمات النانوية. الجسيمات النانوية الدهنية وضعت مع الدهون المؤينة المختلفة ولكن نفس نسبة الأمين إلى الفوسفات، تظهر تغييرا كبيرا في كفاءة التغليف، فضلا عن اختلافات طفيفة في قطر الجسيمات. يؤدي تغليف الحمض النووي البلازميد إلى جزيئات أكبر مقارنة بجسيمات نانوية دهون مغلفة بال mRA ، على الرغم من أن كلا النوعين من الجسيمات النانوية يظهران كفاءة تغليف مماثلة.

ومع ذلك، لا تؤثر التغييرات في معلمة عملية معدل التدفق على تطور الجسيمات النانوية الدهنية. الجسيمات النانوية الدهنية لها تطبيقات كبيرة، والمثال المثالي هو اللقاحات COVID-19 التي تمت الموافقة عليها مؤخرا. هذه التقنية بمثابة مجموعة أدوات كبيرة ويمهد الطريق للتطبيقات في المستقبل من خلال السماح لفحص صياغة الطرف السفلي.