تسليم مركب البروتين الريبي النووي Cas9/sgRNA في الخلايا الخالدة والأولية عبر جزيئات تشبه الفيروسات ("الشفرات النانوية")

سمحت الشفرات النانوية بالتسليم السريع والفعال والمعتمد على الجرعة لمجمع Cas9 والحمض النووي الريبي الموجه ، سواء في الخلايا الخالدة أو الأولية ، وفي غياب مضادات التحويل الجيني. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أن الشفرات النانوية سهلة وغير مكلفة نسبيا للتحضير. يمكنهم تسليم Cas9 وتوجيه مجمع الحمض النووي الريبي بطريقة تعتمد على الجرعة وعابرة ، وبالتالي الحد من التأثيرات غير المستهدفة ، مع السماح بتحرير الجينوم بكفاءة.

بروتوكول التحضير للشفرات النانوية بسيط للغاية. ومع ذلك ، فإن جودة الخلايا المنتجة ، وكذلك أصلها وبذرها قبل النقل ، ضرورية من أجل الحصول على غلات عالية من الجسيمات الشبيهة بالفيروس. ستوضح الإجراء لورا غيغيتاز ، مهندسة من مختبري.

في اليوم الأول ، زرع 3.5 إلى 4 ملايين خلية HEK 293T في 10 ملليلتر من DMEM المعدل والبنسلين الستربتومايسين في طبق زراعة الخلايا 10 سم. بعد 24 ساعة ، عندما تصل الخلايا إلى التقاء 70٪ ، استبدل الوسط ب DMEM طازج واستخدم ماصة P-1000 لإضافة محلول كاشف النقل بطريقة حكيمة. ابدأ في حصاد الشفرات النانوية في اليوم الرابع من خلال جمع السوبرناتانت المتوسطة المستزرعة باستخدام ماصة سعة 10 ملليلتر.

من الطبيعي أن يتحول لون وسط الثقافة إلى اللون الأصفر في هذه المرحلة. قم بطرد مركزي للجهاز الفائق الذي تم جمعه عند 500 G لمدة خمس دقائق لإزالة الحطام الخلوي ، واستعادة تسعة ملليلتر من supernatant دون إزعاج حبيبات الخلية. اسكب الشفرات النانوية في جهاز طرد مركزي فائق عند 209 ، 490 جم لمدة 75 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

بعد الطرد المركزي ، قم بشفط الوسط ببطء وأعد تعليق الكريات البيضاء مع 100 ميكرولتر من PBS البارد. قم بتغطية الأنبوب بالبارافيلم واحتضنه لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية مع إثارة لطيفة. ثم ، أعد تعليق الكريات مرة أخرى عن طريق السحب لأعلى ولأسفل.

قم بإعداد محلول سكروز بنسبة 10٪ في PBS وقم بتصفيته من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر. ضع 2.5 ملليلتر من 10٪ من السكروز في أنبوب جهاز طرد مركزي فائق. قم بإمالة الأنبوب وأضف ببطء تسعة ملليلترات من العينة المحتوية على VLP باستخدام ماصة منخفضة السرعة مع رفع الأنبوب تدريجيا إلى وضع رأسي.

ضع الأنابيب في دلاء الدوار ، ثم قم بالطرد المركزي للعينات عند 209 ، 490 جم لمدة 90 دقيقة عند أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة supernatant بعناية ووضع الأنبوب رأسا على عقب على المناديل الورقية لإزالة أي سائل متبقي. لأغراض تعليمية وتصور أفضل للحبيبات الفيروسية ، يمكن تحضير شفرات نانوية محملة بالبروتين الفلوري mCherry.

بعد دقيقة واحدة ، أضف 100 ميكرولتر من PBS. ضع الأنبوب بغطاء بارافيلم في حامل أنبوب على طاولة تحريك لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية ، وأعد تعليق الكريات عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. قم بإعداد المخزن المؤقت للتخفيف عن طريق إضافة حجم واحد من المخزن المؤقت للتحلل يحتوي على خافض للتوتر السطحي غير الأيوني في أربعة مجلدات من PBS.

قم بتخفيف ميكرولترين من الشفرات النانوية المركزة في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتخفيف والدوامة لفترة وجيزة. انقل 25 ميكرولتر من الخليط إلى أنبوب جديد يحتوي على 25 ميكرولتر من مخزن التخفيف المؤقت وكرر الإجراء للحصول على ستة أنابيب من تخفيفات الشفرة النانوية. قم بإجراء التحكم القياسي عن طريق إضافة ميكرولترين من نوكليز Cas9 المؤتلف إلى 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتخفيف ، ودوامته لفترة وجيزة ، وقم بعمل ثمانية تخفيفات تسلسلية.

ضع 2.5 ميكرولتر من كل تخفيف VLP ، و 2.5 ميكرولتر من كل معيار على غشاء نيتروسليلوز بعناية باستخدام ماصة متعددة القنوات. بمجرد امتصاص الجسيمات ، قم بسد الغشاء باستخدام TBST المكمل بالحليب الجاف الخالي من الدسم بنسبة 5٪ لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تخلص من TBST واحتضن الغشاء بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية باستخدام الجسم المضاد للبيروكسيديز الفجل Cas9.

اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام TBST وتصور الإشارة باستخدام مجموعة ركيزة كيميائية محسنة. لنقل الخلايا المستهدفة بشفرات نانوية ، استبدل وسط زراعة الخلايا ب 500 ميكرولتر من الوسط الذي يحتوي على شفرات نانوية نقية. بعد أربع إلى ست ساعات من حضانة الخلايا ، استبدل الوسط بالكمية الطبيعية من الوسط الطازج.

في البروتوكول ، تم زرع الخلايا للتوزيع المتجانس مع التقاء 70 إلى 80 ٪ في يوم النقل ، وتشكيل خلوية تؤدي إلى خلايا أكبر مع نوى متعددة بعد 24 ساعة. بعد 40 ساعة من النقل ، شكلت معظم الخلايا syncytia وبدأت في الانفصال عن اللوحة. تم تحديد كمية Cas9 المحملة داخل الشفرات النانوية باستخدام لطخة نقطية على غشاء نيتروسليلوز ، والذي أظهر تلألؤا كيميائيا محسنا مقارنة بالمؤتلف المرجعي Cas9.

تم رسم منحنى معايرة لإشارة التلألؤ الكيميائي الكمي لتخفيفات Cas9 المؤتلفة مقابل الكمية المعروفة من Cas9. بعد ذلك ، تم تعيين تركيز بروتين Cas9 في كل مستحضر نانوي ، مما كشف عن تركيزات مختلفة من Cas9 من دفعة إلى أخرى. أظهر فحص إندونوكليز T7 أن كفاءة الشفرات النانوية يمكن أن تختلف من دفعة إلى أخرى.

على سبيل المثال ، لوحظ أن إحدى الدفعات لديها كفاءة تحرير إجمالية بنسبة 20٪ ، بينما أظهرت الدفعة الأخرى كفاءة بنسبة 60٪. تم ترسيب بروتينات Flag-DDX3 المناعية باستخدام حبات الأغاروز المضادة للعلم ، تليها تحليل اللطخة الغربية للبروتينات المستردة باستخدام جسم مضاد مضاد للعلم. كما تم فحص الإدراج الموجه للموقع لعلامة العلم في موضع DDX3 بواسطة PCR باستخدام إما الاشعال المحيطة بموقع الإدراج ، أو الاشعال الأمامية والخلفية الخاصة بموقع DDX3 في اتجاه المصب لموقع إدراج العلم.

من المهم وضع الخلايا عند التقاء صحيح ، والحصول على توزيع متساو للخلايا. عند الطرد المركزي بالشفرة النانوية ، من المهم أيضا إعادة تعليق الكريات والحصول على عينة متجانسة من الجسيمات الفيروسية المركزة. وقد مكنت الشفرات النانوية العلماء من دراسة آلية إصلاح كسر الحمض النووي المزدوج من خلال تسليم Cas9 وتوجيه مجمع الحمض النووي الريبي إلى مواقع جينومية محددة بطريقة سريعة ومنسقة.

كما أنها جعلت من الممكن تعطيل الحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر في الخلايا الأولية للجهاز المناعي الفطري من أجل دراسة دورها.