Cryo-EM وتحليل الجسيمات المفردة مع Scipion

يوفر Scipion الأدوات اللازمة لإنشاء سير عمل المعالجة بالكامل بطريقة تكاملية لتحليل جسيم واحد في cryo-EM لتحقيق إعادة بناء عالية الدقة للعينة البيولوجية. هذا الإطار يجعل من الممكن إنشاء سير العمل معالجة باستخدام عدة حزم معالجة الصور ، ويفضل التشغيل البيني ، والتتبع ، والاستنساخ ، والجمع بين المعلومات التي تنقلها أساليب مختلفة لتوليد إخراج أكثر دقة. Scipion ينمو باستمرار ، بما في ذلك أساليب جديدة وحزم.

وعلاوة على ذلك، فقد تم توسيع نطاقه ليشمل التصوير المقطعي بالإلكترونات المبردة والنمذجة الذرية، مما يسمح أيضا بإنشاء سير عمل لمعالجة هذه البيانات. لإنشاء مشروع في Scipion، انقر فوق إنشاء مشروع لإنشاء المشروع. لاستيراد أفلام المجهر، حدد استيراد الأفلام.

ستظهر نافذة جديدة. في هذه النافذة، أدخل المسار إلى البيانات وتعيين الجهد المجهر إلى 300 كيلوفولت، انحراف كروي إلى ملليمترين، والسعة على النقيض من 0.1، ومعدل التكبير إلى 50، 000، ووضع معدل أخذ العينات إلى من الصورة، وحجم بكسل إلى 1.34 angstroms. عند تعيين كافة المعلمات انقر فوق تنفيذ.

عند انتهاء الأسلوب، افتح علامة التبويب ملخص انقر فوق تحليل النتائج. ستظهر نافذة جديدة مع قائمة المخرجات التي تم إنشاؤها بواسطة الأسلوب. لتشغيل طريقة التدفق البصري لمحاذاة الأفلام، افتح طريقة المحاذاة البصرية xmipp3، وحدد الأفلام المستوردة كالأفلام المدخلة، ثم قم بتعيين نطاق الإطارات إلى ALIGN من 2 إلى 13.

ضمن معلمات إضافية، قم بتعيين استخدام محاذاة الفيلم السابق إلى SUM frames الخيار إلى No.Leave كافة الخيارات الأخرى تعيين إلى القيم الافتراضية الخاصة بهم وتنفيذ البرنامج. انقر على تحليل النتائج للتحقق من الصور الدقيقة التي تم الحصول عليها ومسار التحولات المقدرة. لكل ميكروجراف، من الممكن التحقق من كثافة الطيفية للطاقة، والمسارات التي تم الحصول عليها لمحاذاة الفيلم في كل من الإحداثيات الديكارتية والقطبية، واسم ملف المجهر الذي تم الحصول عليه.

لاحظ أن جزيئات العينة أكثر وضوحا في المجهر بالمقارنة مع إطار واحد من الفيلم. بالنسبة لانتقاء الجسيمات، افتح طريقة الانتقاء اليدوي xmipp3 وحدد الميكروجرافات التي تم الحصول عليها مسبقا كميكروجرافات الإدخال. انقر فوق تنفيذ.

ستظهر نافذة تفاعلية جديدة. في هذه النافذة، تغيير حجم البكسل إلى 150. ستظهر الصورة المصغرة المحددة في نافذة أكبر.

اختر جميع الجسيمات المرئية داخل منطقة واحدة. عندما يتم اختيار جميع الجسيمات يدويا، انقر فوق تنشيط التدريب لبدء التعلم. سيتم اختيار المناطق المتبقية من المجهر تلقائيا.

تحقق من الجسيمات الانتقاء. لتضمين جسيم إضافي، انقر على جسيم مهم. لإزالة أي جزيئات غير صحيحة، اضغط على Shift وانقر فوق الجسيمات حسب الضرورة.

عندما يتم اختيار جميع الجسيمات تلقائيا، حدد الميكروجرافات الأربعة التالية واحدة في كل مرة لإنشاء مجموعة تدريب تمثيلية. سيتم اختيار الجسيمات في كل ميكروجراف مختار تلقائيا ، والتحقق من كل ميكروجراف لتضمين أو إزالة الجسيمات حسب الضرورة. عند الحصول على مجموعة تدريب، انقر فوق الإحداثيات لحفظ إحداثيات جميع الجسيمات التي تم انتقاؤها.

بعد الحصول على مجموعة التدريب ، فتح xmipp3 لصناعة السيارات في اختيار للإشارة إلى قطف اليدوي السابق في Xmipp الجسيمات اختيار تشغيل وتعيين Micrographs لاختيار نفس تحت إشراف. انقر فوق تنفيذ لإنشاء مجموعة من حوالي 100, 000 إحداثيات. لتطبيق نهج توافق الآراء ، وفتح sphire cryolo قطف وتعيين micrographs معالجتها مسبقا كما micrographs المدخلات في نموذج الانتقاء إلى الافتراضي.

تعيين عتبة الثقة إلى 0.3 وحجم مربع إلى 150، ثم انقر فوق تنفيذ. يجب أن تقوم الطريقة أيضا بإنشاء حوالي 100,000 إحداثيات. بعد ذلك، افتح اختيار توافق آراء عميق xmipp3 وتعيين إحداثيات الإدخال لتضمين إخراج cryolo sphire و xmipp3 التلقائي الانتقاء، نوع نموذج تحديد إلى مدربة مسبقا، والتدريب تخطي والنتيجة مباشرة مع نموذج مدربة مسبقا إلى نعم، ثم انقر فوق تنفيذ.

في نهاية التنفيذ، انقر فوق تحليل النتائج. في النافذة الجديدة، انقر فوق أيقونة العين. ستفتح نافذة جديدة ثانية مع قائمة بجميع الجسيمات.

سوف تعطي قيم نقاط Z في العمود نظرة ثاقبة على جودة كل جسيم ، حيث أن القيمة المنخفضة تدل على جودة رديئة. لطلب الجسيمات من أعلى إلى أدنى درجة Z، انقر فوق Xmipp Z-score التعلم العميق وحدد الجسيمات مع درجة Z أعلى من 0.75. ثم انقر فوق إحداثيات لإنشاء مجموعة فرعية جديدة مع إحداثيات 50,000 تقريبا.

لحساب الدقة محليا، افتح xmipp3 MonoRes المحلية وتعيين وحدة تخزين الإدخال إلى إخراج الخطوة التحسين الأخيرة، هل ترغب في استخدام half وحدات التخزين إلى نعم، ونطاق الدقة من 1 إلى 10 angstroms. عند تعيين المعلمات، انقر فوق تنفيذ. عند حساب الدقة، انقر فوق تحليل النتائج وحدد إظهار الرسم التكراري للدقة وعرض الشرائح الملونة.

سيتم عرض الدقة في الأجزاء المختلفة من وحدة التخزين. وينبغي أن تمثل معظم ال voxels الأجزاء المركزية من الهياكل قرارات حول ثلاثة angstroms ، في حين سيتم رصد أسوأ القرارات في المناطق الخارجية من الهياكل. كما سيتم عرض رسم بياني للقرارات لكل voxel مع ذروة حول أو أقل من ثلاثة angstroms.

لتطبيق شحذ، فتح xmipp3 localdeblur شحذ وتحديد الإخراج من الخطوة التحسين الأخير كما خريطة الإدخال، وتعيين خريطة القرار للحصول على خريطة مونوريس. بعد تنفيذ الأمر، انقر نقرا مزدوجا فوق مجموعة وحدات التخزين التي تم إنشاؤها كخرج في علامة التبويب ملخص. يمكن التحقق من وحدات التخزين التي تم إنشاؤها في كل تكرار.

كما يوصى بفتح وحدة التخزين باستخدام أدوات أخرى، مثل UCSF Chimera، لمراقبة ميزات وحدة التخزين بشكل أفضل في الأبعاد ثلاثية الأبعاد. في هذا الرقم ، يمكن ملاحظة ارتباط قذيفة فورييه من ثلاثة angstroms ، وهو قريب جدا من حد Nyquist. كما هو موضح، شرائح حجم 3D أعيد بناؤها تظهر مستوى عال من التفاصيل والهياكل محددة جيدا.

بعد التحليل المحلي ، فإن معظم voxels المركزية تحقيق قرار أقل من ثلاثة angstroms. غير أن المناطق الخارجية لشرائح الاستبانة المحلية تظهر دقة أقل تتسق مع الضبابية الملاحظة داخل تلك المناطق. بعد المعالجة اللاحقة، يمكن ملاحظة الترددات العالية لحجم الخريطة ثلاثية الأبعاد، مما يكشف عن مزيد من التفاصيل ويحسن التمثيل.

عندما يكون القرار الذي تحقق عالية بما فيه الكفاية، حتى بعض الأجزاء الكيميائية الحيوية من الهيكل يمكن ملاحظتها. إذا كان الهيكل الذي تم الحصول عليه منخفض الدقة ، ولم يكن قادرا على التطور إلى هيكل أفضل ، يمكن ملاحظة حجم غير واضح مع ارتباط منخفض لقذيفة فورييه ، ومنحنى الدقة ، والمسكون التكراري للتقدير المحلي. بعد الانتقاء، يمكن فحص التصنيف 2D لتقييم جودة الجسيمات.

على سبيل المثال، في هذا التصنيف، تكون الجسيمات صاخبة أو غير مركزة أو مقترنة، مما يشير إلى أن الانتقاء غير صحيح. يمكن إجراء نقطة تفتيش أخرى أثناء تقدير الحجم الأولي. في هذا المثال، تم إنشاء تقدير سيئ باستخدام إعداد غير صحيح للأسلوب.

وبمجرد إنتاج خريطة ثلاثية الأبعاد بدقة كافية، فإن الخطوة التالية هي اقتراح نموذج ذري للخريطة. ويمكن القيام بذلك داخل Scipion باستخدام الإضافات النمذجة. ويمكن استخدام هذه التقنية لإعادة بناء الجزيئات البيولوجية بنجاح لتقييم تفاعلاتها الجزيئية ووظيفة الفرقة البيولوجية كأساس لتصميم الأدوية.