فحص الأجزاء القائم على الرنين المغناطيسي النووي في الحد الأدنى من العينة ولكن وضع الأتمتة الأقصى

نجري دراسات الرنين المغناطيسي النووي. وهذا يسمح لنا بتحديد تراكيب البروتينات والحمض النووي الريبوزي (RNA) والحمض النووي (DNA) في المحلول. هذه الجزيئات الحيوية هي المكونات ، وهي مكونات خلايانا ، وبروتوكولاتنا التي نقدمها هنا تهتم بفحص الجزيئات الصغيرة وارتباطها بهذه الأهداف.

من هذه الجزيئات ، يمكن للكيمياء الطبية والبيولوجيا الهيكلية لدينا أن تستمد أدوية جديدة تكافح الأمراض. الميزة الرئيسية لتقنيتنا هي أن لدينا سيطرة كاملة على جودة الأهداف الجزيئية ، مثل البروتينات ، ولدينا سيطرة كاملة على جودة شظايا الجزيئات الصغيرة والأدوية ، ويمكننا أيضا فحص البروتينات لربطها بمجموعة واسعة من الصلات ، وهي ميزة مقارنة بالمنهجيات الأخرى. لتحضير عينات غربال لقياس الرنين المغناطيسي النووي ، استخدم روبوت تحضير العينات لتوزيع 768 مركبا في ثمانية ألواح من 96 بئرا للحصول على 64 مخاليطا تحتوي على 12 قطعة بتركيز نهائي قدره 4.2 مليمول لكل خليط.

انقل الهدف الجزيئي الحيوي محل الاهتمام ، المخفف في مخزن مؤقت مناسب للفحص ، إلى العدد المناسب من أنابيب مغير العينات عالية الإنتاجية NMR ذات الثلاثة ملليمترات المشفرة ، واستخدم الروبوت لنقل 10 ميكرولتر من كل خليط ليجند إلى كل أنبوب من الجزيء الحيوي المستهدف. بعد ذلك ، اطلب من الروبوت مزج الحلول جيدا. للحصول على الرنين المغناطيسي النووي ، قم بتحميل العينة في مقياس الطيف.

افتح برنامج مقياس الطيف ، ثم حدد مجموعة المعلمات وتسلسل النبض للتجارب القائمة على الرباط. بالنسبة لجميع التجارب المدرجة ، حدد نحت الإثارة كقمع للمياه. لفحص الفلور -19 ، حدد كل من تجارب 1D و T2.

حدد العرض الطيفي إلى 220 جزءا في المليون ، وتردد الإثارة إلى 140 جزءا في المليون ، ووقت التحليل بين ساعة إلى خمس ساعات. بالنسبة إلى T2 ، يجب أن يتناوب وقت CPMG بين 5 و 100 مللي ثانية. سجل تجارب T1r و T2.

سجل فرق نقل التشبع ك2D زائف. لمعالجة اثنين من أطياف 1D واحدة ، استخدم وظيفة برنامج الاتحاد الأفريقي ProcStd ، مع أو بدون خيار الاسترخاء. WaterLOGSY هو 1D واحد يجب أن يكون على مراحل مع سلبية لإشارة المذيب.

لتحليل بيانات فحص الهيدروجين ، اتبع التعليمات الخاصة بأداة الفحص القائمة على الشظايا لتخزين بيانات الرنين المغناطيسي المغناطيسي الجزيئي الحيوي من حملات الفحص ، بحيث يكون لكل خليط فحص دليله الذي يحتوي فيه دليل فرعي على التجارب المختلفة المقاسة على العينة. قم بتخزين الأطياف المرجعية ، مع حفظ جميع البيانات من العينات بدون الهدف الجزيئي الحيوي ، ولكن مع المخاليط والمركب الفردي في أدلة مختلفة. قم بإنشاء مسار مباشر إلى الدليل الذي يحتوي على البيانات المكتسبة ، وحدد دليل الرنين المغناطيسي النووي الذي يجب أن يكون فيه لجميع المخاليط دليل مميز.

تأكد أيضا من نسخ ملفات CSV وشاشة الأجزاء ومستند XML وملفات BAC إلى دليل NMR للبيانات. لاستخدام أداة الغربلة المستندة إلى الأجزاء لعينة تم فحصها، اسحب رمز مشروع الفرز المستند إلى الأجزاء إلى منتصف نافذة التحليل. يجب أن يظهر الرمز إذا تم نسخ مجموعات البيانات المحفوظة مسبقا فيه.

يجب أن تفتح نافذة خيارات الفحص المستندة إلى الأجزاء تلقائيا. حدد ملف كوكتيل CSV يحتوي على أسماء الخلطات وأسماء كل جزء وتقسيم كل جزء إلى المزيج. حدد مجلد أطياف ليجند مرجعي مع جميع الأطياف المقاسة للأجزاء الفردية ، وحدد مجلد تجربة فارغ مرجعي ، والذي يحتوي عادة على مجموعات بيانات الخلطات بدون الهدف الذي تم التحقيق فيه.

لتحديد ألوان عرض الأطياف والأطياف التي تم فحصها، افتح علامة التبويب أنواع الأطياف وقم بتعيين نوع المواصفات وفقا لبيانات العملية. في علامة التبويب تخطيط العرض، حدد الأطياف التي ستتم مقارنتها وفقا لأنواع المواصفات. ثم انقر فوق موافق لبدء المشروع.

أثناء معالجة البيانات ، سيتم فتح نافذة منفصلة مع الجدول الذي يلخص جميع خلطات الكوكتيل وروابط كل مزيج. انقر نقرا مزدوجا فوق خلية لفتح مجموعات البيانات المعنية. قبل تعيين المجلدات ، تأكد من أن القمم المرجعية تتطابق مع بعضها البعض ولها نفس التحول الكيميائي.

إذا لوحظت اختلافات ، فافتح علامة التبويب عملية ، واستخدم خيار المعالجة التسلسلية لتصحيحها. للتحليل الأول لمخاليط الفلور -19 ، افتح علامة التبويب تحليل وحدد وظيفة التكامل. تأكد من تحديد منطقة تكامل واضحة لإشارة الفلور -19 المقابلة لكل جزء في الخليط.

احفظ مناطق تكامل التصدير لتصدير ملف التكامل للاستخدام في المستقبل، واحفظ أي ملفات تكامل مستخدمة في دليل التثبيت المناسب. بالنسبة لبيانات الفلور-19، افتح مجموعة بيانات مع أو بدون الهدف الذي تم التحقق منه، وضمن علامة التبويب تحليل، انقر فوق تكامل وقراءة مناطق تكامل الاستيراد لتحميل ملف التكامل المقابل في الطيف الحالي. ثم انقر فوق حفظ والعودة لتحديد موقع قائمة بالمناطق المتكاملة في علامة التبويب التكاملات، وانسخ هذه المعلومات إلى جدول بيانات لتحليل المصب.

يتم تحليل التركيب الجزيئي أو تكوين الروابط في مكتبة الأجزاء باستخدام برنامج الثقة الجزيئية كما هو موضح ، ويتم تقديم النتائج كمخرجات رسومية. يشير اللون البرتقالي إلى أن الجزء يظهر عدم تناسق في البنية أو التركيز. تشير الآبار ذات اللون الأخضر إلى أن الجزء متسق.

في هذا التحليل التمثيلي ، تم تقسيم 103 أجزاء تحتوي على مجموعة واحدة أو عدة مجموعات من الفلور من المكتبة الداخلية إلى خمسة خلطات من 20 إلى 21 جزءا لكل خليط. تم قياس تجارب الاسترخاء المستعرض للفلور -19 لكل خليط يطبق قطارات نبض CPMG. العتبات مفيدة لتعريف الموثق أو الرابط الضعيف أو غير الموثق في الخليط ، كما لوحظ في أطياف بروتين الثيامين التيروزين كيناز A و RNA النموذجية.

في هذا التحليل التمثيلي ، أظهرت النتيجة الأولى انخفاضا في T2 بحوالي 50٪ وتحولا كيميائيا أكبر من أو يساوي ستة هرتز. لم يظهر WaterLOGSY تغييرا كبيرا في الإشارة ليتم احتسابها على أنها إيجابية. ومع ذلك ، نظرا لأن تجربتين من أصل ثلاث تجارب كانت إيجابية ، فقد تم احتساب هذه القطعة على أنها ضربة.

بالنسبة للضربة الثانية ، أظهر T2 انخفاضا بنسبة 80٪ تقريبا في شدة الإشارة. كما لوحظ تغيير واضح في الإشارة ل WaterLOGSY. لم يكن التحول الكيميائي كافيا في هذه التجربة ، ولكن نظرا لأن المعيارين السابقين كانا إيجابيين ، فقد تم احتسابه على أنه نجاح.

الهدف النهائي من هذه الأساليب هو تطوير عقاقير جديدة أو مثبطات عالية التقارب ، على سبيل المثال ، الإنزيمات ، وفي هذا ، تتولى الكيمياء الطبية وتوليف هذه الجزيئات الجديدة ، ولكن بيولوجيا البنية ، التقنيات التي تطبقها هنا يمكن أن توجه الكيمياء الطبية وتجعل هذا النهج أسرع.