إنشاء واستخدام نماذج الطعم الخارجي المشتقة من المريض لورم خبيث في الجهاز العصبي المركزي

تم إعاقة تطوير علاجات جديدة لورم خبيث في الجهاز العصبي المركزي بسبب عدم وجود نماذج جيدة قبل السريرية. تلخص نماذج xenograft المشتقة من المريض ورم خبيث في الجهاز العصبي المركزي بشكل أفضل من نماذج خط الخلية المستخدمة تاريخيا. من خلال استخدام طرق مختلفة لتلقيح الورم ، يمكنك دراسة جوانب مختلفة من الشلال النقيلي.

كل مسار له مزايا يمكن الاستفادة منها لدراستك. سيوضح الإجراء بن يي تيو ، زميل ما بعد الدكتوراه من مختبري. لزرع الخاصرة تحت الجلد لأورام PDX المحفوظة بالتبريد، قم بإذابة أنسجة الورم المحفوظة بالتبريد بسرعة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.

ثم اشطفه في خمسة ملليلتر من DPBS في طبق زراعة الأنسجة. بعد ذلك ، بعد التأكد من التخدير في أنثى فأر NOG البالغ من العمر ثلاثة إلى ثمانية أسابيع ، قم بعمل شق من 0.5 إلى سنتيمتر واحد على الجهة اليسرى أو اليمنى وأدخل قطعة واحدة 2 × 2 × 2 ملم من أنسجة الورم بعمق في الجيب. بعد إغلاق الشق ، اسمح للفأر بالتعافي من التخدير مع المراقبة حتى يصبح متنقلا.

بمجرد أن يبدأ الورم في النمو ، قم بقياس الورم ثلاث مرات في الأسبوع باستخدام الفرجار. في نقطة النهاية التجريبية المناسبة ، حدد النقائل من خلال التشريح وتأكد من وجود أورام داخل العضو المستهدف من خلال التحليل النسيجي. ضع ورم PDX المقطوع في DMEM على الجليد.

اغسل الورم في خمسة ملليلتر من DPBS في طبق زراعة الأنسجة وإزالة المناطق الميتة إن وجدت. قطع الورم إلى قطع صغيرة بطول 2 إلى 4 ملليمترات ونقل القطع إلى أنبوب يحتوي على محلول التفكك. باستخدام البرنامج المناسب على جهاز Dissociator ، قم بفصل الأنسجة ميكانيكيا وتصفية تعليق الخلية الناتج من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر.

استخدم 20 ملليلترا من DMEM لغسل أي خلايا متبقية من المصفاة وأجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية المنفصل. بعد ذلك ، أعد تعليق الخلايا و DPBS للعد واضبط الخلايا على تركيز من خمسة إلى 10 مرات 10 إلى الخلايا الرابعة لكل ميكرولتر إلى اثنين من DPBS. لتحضير المنطقة الجراحية ، احلق الفراء على رأس الفأر لكشف فروة الرأس.

بعد ذلك ، ضع الماوس في إطار مجسم ، وقم بتأمين رأس الماوس بإحكام باستخدام قضبان الأذن. تأكد أيضا من تطبيق مسكن مناسب. تطهير فروة الرأس مع ثلاثة الدعك بالتناوب من البوفيدون اليود و 70 ٪ من الإيثانول.

قم بعمل شق طولي من خمسة إلى سبعة ملليمترات لكشف الجمجمة وسحب فروة الرأس. اكشط السمحاق بالملقط لتحديد موقع البريجما. ضع إبرة الإطار التجسيمي أعلى bregma وأعد تعيين الإحداثيات إلى الصفر.

حرك الذراع بمقدار ملليمتر واحد للخلف ومليمتر واحد جانبي إلى يمين خط الوسط ، وقم بتمييز هذا الموقع بعلامة دائمة. بعد ذلك ، قم بحفر ثقب صغير في الجمجمة في الموقع المحدد ، مع الحرص على عدم الحفر في الدماغ. تحميل إلى خمسة ميكرولتر 26 قياس حقنة هاملتون مع واحد إلى اثنين ميكرولتر من الخلايا وإرفاق حقنة إلى الذراع المجسمة.

أدخل الإبرة ببطء مليمترين في الدماغ وابدأ في حقن الخلايا بالمعدل المطلوب. عندما يتم تسليم جميع الخلايا ، اسحب الإبرة ببطء ، واملأ فتحة النتوء بشمع العظام ، وأغلق الشق. ضع الماوس مرة أخرى في قفصه مع المراقبة حتى الشفاء من التخدير.

بعد القتل الرحيم للحيوان في نقطة النهاية التجريبية المناسبة ، تأكد من وجود أورام في الدماغ من خلال التحليل النسيجي. لزرع أورام PDX عن طريق الحقن داخل القلب ، قم بإعداد الخلايا السرطانية كما هو موضح ووضع الفأر المتلقي المخدر في وضع الاستلقاء. حلق الفراء على صدر الحيوان وتطهير الجلد المكشوف مع البوفيدون اليود و 70 ٪ من الإيثانول.

ارسم 0.5 إلى 10 مرات 10 إلى الخلايا السرطانية الخامسة وما يصل إلى 100 ميكرولتر من DPBS في حقنة مجهزة بإبرة قياس 28. حدد موقع الحقن على يسار القص قليلا في منتصف المسافة بين الشق القصي وعملية الخنجري. ثم أدخل الإبرة عموديا في الماوس في موقع الحقن.

بمجرد ملاحظة التدفق العكسي ، مما يشير إلى دخول ناجح للإبرة إلى البطين الأيسر ، قم بتوزيع تعليق الورم ببطء في البطين الأيسر دون تحريك الإبرة. عندما يتم تسليم جميع الخلايا ، اسحب الإبرة ببطء وعموديا وضع قطعة من الشاش المعقم على موقع الحقن لمدة دقيقة واحدة تقريبا حتى يتوقف النزيف. اسمح للماوس بالتعافي على وسادة ساخنة مع المراقبة حتى يصبح متنقلا.

في نقطة النهاية التجريبية المناسبة ، حدد النقائل من خلال التشريح وتأكد من وجود أورام داخل العضو المستهدف من خلال التحليل النسيجي. على الرغم من الاختلافات في البيئة المكروية للورم ، تظهر أورام PDX مورفولوجيا مماثلة تحتوي على خلايا ذات نوى صغيرة وسيتوبلازم ضئيل ، بغض النظر عن موقع الزرع. في هذا التحليل ، أدى الحقن داخل القلب لخلايا سرطان الجلد البشري إلى نقائل الخلايا السرطانية إلى دماغ الفأر ، في حين أن الحقن داخل القلب للخلايا السرطانية البشرية الصغيرة الخلايا السرطانية أدى إلى ورم خبيث في تجويف البطن والكبد الفأر.

تمكن هذه البروتوكولات من إعداد دراسات ما قبل السريرية لاختبار العلاجات الجديدة ومجموعات العلاج ، ويمكن أن تساعد في دراسة العمليات البيولوجية وورم خبيث للورم.