مطياف مفلور فعال من حيث الوقت لتقييم حالة البلمرة في القوارض وأنسجة الدماغ البشرية
June 3rd, 2021
نحن نبلغ عن فحص بسيط وفعال للوقت وعالي الإنتاجية يستند إلى التحليل الطيفي للتحديد الكمي لخيوط أكتين في عينات بيولوجية من أنسجة الدماغ للقوارض والموضوعات البشرية.
أكتين هو المكون الرئيسي للهيكل الخلوي وينظم بشكل حاسم عدة جوانب من مورفولوجيا الخلوية وعلم وظائف الأعضاء، بما في ذلك في الخلايا العصبية. Actin يحدث في توازن بين شكليه، أحادية الكبيبة G-أكتين أو بخيوط البوليمرية F-actin. يتم تنظيم حالة البلمرة من actin بشكل صارم على مستويات متعددة سواء عن طريق البروتينات الملزمة actin ، فضلا عن تنظيمها الخاص بعد الترجمة.
في الاتصالات متشابك الداخلي، والتعديلات الديناميكية في مستويات F-actin هي حدث تنظيمي رئيسي، والسيطرة على الإشارات واللدونة في كل من محطات ما قبل وبعد متشابك. ليس من المستغرب، يرتبط الخلل الوظيفي actin إلى العديد من الحالات العصبية. وقد أدت التطورات الأخيرة إلى ثروة من المعرفة actin في فسيولوجيا الخلايا العصبية والفيزيولوجيا المرضية.
ومع ذلك لا يزال هناك الكثير غير معروف ويحتاج إلى التركيز عليه. وفي هذا الصدد، أثبتت النظائر الفلورية لل phalloidin أن تكون أداة رئيسية في البحوث أكتين. يرتبط هذا الفالوتوكين على وجه التحديد بال أكتين الخيطي ، وبالتالي يمكن استخدامه كمقياس مباشر لكميات F-actin ، وتغييره في الحالات المرضية الفسيولوجية.
تقدم هذه الدراسة تقييمافلوريا سريعا وفعالا لتقييم حالة البلمرة actin في العينات البيولوجية السابقة في الجسم الحي ، مثل المتجانسات بالجملة والمحطات المتشابكة المعزولة كيميائيا من أنسجة الدماغ. وتجدر الإشارة إلى أنه يمكن تطبيق المقايسة على أنواع الخلايا والأنسجة الأخرى وما يرتبط بها من ظاهرة فسيولوجية. للحصول على وصفات المخازن المؤقتة المستخدمة في هذه الدراسة، يرجى الرجوع إلى النص التفصيلي.
تم تجانس عينات أنسجة الدماغ من الفئران أو البشر في أنبوب زجاجي بوتر-إلفيهم والحشرات على الجليد في 10 مجلدات من العازلة التجانس. لإعداد النايبتوسوم، تم نسج المتجانسة أولا بسرعة بطيئة ومن ثم بسرعة أعلى للحصول على كسر الميتوكوندريا النابتوسوم الخام. تم الحصول على السنابتوسومات المخصبة من هذا الكسر الخام بعد تدرج السكروز المتقطع.
لإعداد المشبكية، تم تمرير التجانسات بالتسلسل من خلال اثنين 100 ميكرون ومرشح واحد 5 ميكرون. تم إجراء تقدير البروتين باستخدام كاشف برادفورد وتم تخفيف العينات في عازل كريبس بتركيز من 2 إلى 3 ملليغرام لكل بروتين مل في حجم نهائي قدره 50 ميكرولتر. تم تحفيز المحطات المتشابكة المعزولة ، إما النايبوسومات أو synaptoneurosomes ، من خلال زيادة قصيرة 30 ثانية في البوتاسيوم خارج الخلية عند 37 درجة.
لهذا، تمت إضافة كلوريد البوتاسيوم الضرس واحد إلى العينات إلى تركيز النهائي من 15 ملليمولار. التجانسات غير منبهة وتم إصلاح شظايا متشابكة غير ملوثة مع 2.5٪ غلوتارالدهيد، بإضافة الحجم المطلوب من محلول مخزون glutaraldehyde بنسبة 25٪. تم احتضان العينات لمدة دقيقتين أو ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة.
تمت إزالة المثبت عن طريق الطرد المركزي في 20, 000 G لمدة خمس دقائق. ثم تم المضي قدما في العينات لبيرمابيليتيون عن طريق إعادة الإنفاق في العازلة كريبس التي تحتوي على 0.1٪ تريتون X-100 و 1 ملغ لكل مل بوروهيدريد الصوديوم لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. تمت إزالة المخزن المؤقت Permeabilization مرة أخرى عن طريق الطرد المركزي وغسلت بيليه سطحيا مع عازل كريبس وإعادة إنفاقها في عازل كريبس التي تحتوي على 1X اليكسا فلور 647 phalloidin، المقابلة ل 500 وحدة صغيرة من phalloidin.
وسمح ملزمة للمضي قدما لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام. تمت إزالة ال phalloidin الزائدة غير المنضمة من العينات عن طريق الطرد المركزي في 20،000 G لمدة خمس دقائق ، وغسلت الكريات سطحيا مع عازل كريبس ، وإعادة إنفاقها مرة أخرى في عازل كريبس التي تحتوي على 0.32 السكروز الضرس للحفاظ على الطفو من النافتوسومات أو synaptoneurosomes. تم الاستغناء عن عينات phalloidin الفلورسنت ملزمة في لوحة سوداء 96 جيدا للقراءة الفلورية في قارئ لوحة.
تم تعيين الأطوال الموجية للإثارة والانبعاثات عند 645 نانومتر و 670 نانومتر على التوالي. لكل مجموعة من التجارب أدرجنا كميات مختلفة من اليكسا فلور 647 phalloidin في العازلة كريبس التي تحتوي على 0.32 السكروز المولار. ولحصر أي خسائر في العينات أثناء خطوات الغسيل، نقلت العينات من اللوح الأسود إلى صفيحة البئر الشفافة 96.
ثم تم فحص التقاط العينات في 440 نانومتر. الاحتفاظ phalloidin الفلورسنت يتناسب مباشرة مع كمية خيوط أكتين أو مستويات F-actin في العينات. لوحظ خطية ربط phalloidin في نطاق 50 إلى 200 ميكروجرام من البروتينات.
كدليل على المبدأ، اختبرنا أيضا فعالية المقايسة لدينا في نماذج لDypolymerization F-actin باستخدام تعطيل الدوائية من خيوط أكتين من قبل Latrunculin A، فضلا عن تحفيز تشكيل F-actin بواسطة KCl بوساطة تحفيز المحطات متشابك معزولة. ويمكن التعبير عن انبعاث الفلورسينس من phalloidin ملزمة إما وحدات من phalloidin ملزمة ولدت من منحنى خطي القياسية ونسبة إلى عينات التحكم. بالنسبة للأرقام 4، يتم التعبير عن مستويات F-actin كوحدات صغيرة من phalloidin المقيد.
ومن ناحية أخرى، بالنسبة لمستويات الشكل 5 F-actin في شظايا متشابكة إزالة الاستقطاب يتم التعبير عنها بالنسبة للعينات غير القطبة التحكم. نحن نصف قوية، كفاءة الوقت وارتفاع الإنتاجية المقايسة لتحليل خيوط أكتين، أو F-actin، وتعديلاته في الدول الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية مناسبة لشكل لوحة بئر 96. إن المقايسة أسرع بكثير من البروتوكولات البديلة القائمة ويمكن أن تكون بمثابة أداة أساسية في الدراسات المتعلقة بال أكتين، إما بمفردها أو بالاشتراك مع الكيمياء المناعية القائمة والمقايسات الغربية القائمة على النشاف.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة طريقة فحص قائمة على القياس الطيفي للفلورية عالية الإنتاجية لتحديد كميات خيوط الأكتين في العينات البيولوجية ex vivo، خاصة من أنسجة الدماغ للقوارض والبشر. وهي تبحث في حالة بلمرة الأكتين، وهي حاسمة لفهم العمليات الخلوية في الخلايا العصبية والأمراض العصبية ذات الصلة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- القياس الطيفي للفلورية
الخلفية
- الأكتين هو مكون رئيسي من الهيكل الخلوي، ويؤثر على مورفولوجيا ووظيفة الخلايا العصبية.
- التوازن الديناميكي بين الأكتين أحادى الوحدة G-actin والأكتين البوليمري F-actin بالغ الأهمية للعمليات الخلوية.
- التغييرات في مستويات F-actin تلعب دورًا كبيرًا في الإشارة المشبكية واللدونة.
- اختلال وظيفة الأكتين مرتبط بالعديد من الأمراض العصبية، مما يسلط الضوء على الحاجة إلى طرق تقييم موثوقة.
هدف الدراسة
- لتطوير طريقة فحص سريعة وفعالة لتقييم بلمرة الأكتين في العينات البيولوجية.
- لتمكين التحليل عالي الإنتاجية لـ F-actin في كل من الظروف الفسيولوجية والمرضية.
- لتوحيد طريقة قابلة للتطبيق على أنواع مختلفة من الخلايا وظاهراتها الفسيولوجية.
الطرق المستخدمة
- يستخدم الفحص العينات البيولوجية ex vivo من أنسجة الدماغ، بما في ذلك المستخلصات والعضيات المشبكية.
- تمت معالجة أنسجة الدماغ للقوارض والبشر لعزِل المشبكونات والمشبكونات العصبية للتحليل.
- تم استخدام الفالويدين الفلوري لقياس مستويات F-actin مباشرة.
- تم حضانة العينات مع الفالويدين وتحليلها باستخدام قارئ لوحي، مع إعدادات تحفيز وإصدار محددة.
- تم التحقق من كفاءة الفحص باستخدام التعديل الدوائي لديناميكيات الأكتين.
النتائج الرئيسية
- قدم الفحص مقياسًا قويًا وقابلاً للتطوير لمستويات F-actin، مع ملاحظة خطية في تركيزات البروتين.
- أظهر فعالية في كشف التغيرات في بلمرة الأكتين استجابة للتلاعب التجريبي.
- تتيح الطبيعة السريعة للفحص التقييم المتزامن للعديد من العينات، مما يزيد من الإنتاجية البحثية.
- تم ربط تغييرات F-actin بشكل فعال مع العينات التحكم، مما ينشئ معيارًا موثوقًا للدراسات المستقبلية.
الاستنتاجات
- تحدد هذه الدراسة طريقة فحص جديدة وفعالة لقياس F-actin يمكن أن تدعم الأبحاث المتعلقة بالأكتين في علم الأعصاب.
- الطبيعة عالية الإنتاجية لهذه الطريقة لها آثار مهمة لدراسة ديناميكيات الأكتين في الصحة والمرض.
- قد تفيد النتائج الاستفسارات المستقبلية حول دور الأكتين في الآليات العصبية والأمراض ذات الصلة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of actin polymerization in brain tissue is critical for de-risking neuronal target hypotheses and clarifying synaptic pathway mechanisms in early discovery. This fluorescence-based assay enables rapid, reproducible measurement of F-actin in both rodent and human brain samples, supporting predictive confidence in neurobiology-focused R&D portfolios. Its high-throughput compatibility positions it as a scalable tool for cross-program target validation and mechanistic studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct quantification of F-actin to interrogate synaptic plasticity mechanisms.
- Supports functional target validation by measuring actin dynamics in disease-relevant brain tissue.
- Facilitates mechanistic de-risking of neuronal targets implicated in synaptic dysfunction.
- Provides a platform for comparative analysis across pharmacological and physiological perturbations.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible F-actin quantification suitable for 96-well plate screening formats.
- Enables assay scalability and platform reuse for compound evaluation impacting actin polymerization.
- Supports robust assay development with linear phalloidin binding across defined protein ranges.
- Allows integration with existing immunohistochemistry and Western blotting workflows for orthogonal validation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling F-actin measurement in both rodent and human brain tissues.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of synaptic function modulators.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions by providing quantitative readouts of actin dynamics in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
This assay bridges early discovery and preclinical research by enabling quantitative, high-throughput analysis of actin polymerization in brain tissue homogenates and isolated synaptic terminals.
- Discovery Biology: Provides direct measurement of F-actin to test hypotheses on synaptic structure-function relationships.
- Screening: Offers reproducible, scalable quantification of actin polymerization for compound screening and assay development.
- Analytics: Generates quantitative fluorescence readouts proportional to F-actin content, supporting statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Enables cross-species and cross-sample continuity by applying the same assay to rodent and human brain tissues.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for actin dynamics studies across multiple neuroscience programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in neuronal target validation and reduces mechanistic ambiguity in synaptic research.
- Operational Value: Standardizes F-actin quantification with high-throughput, reproducible workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by providing robust, quantitative actin data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurobiology assets based on validated actin dynamics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence spectroscopy and brain tissue handling.
- Needs access to plate readers capable of detecting Alexa Fluor 647 emission.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and phalloidin labeling protocols.
- Adaptable to various brain regions and potentially other tissue types with protocol optimization.
- Linearity and sensitivity are defined within specific protein concentration ranges (50–200 µg).
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:49
Preparation of Buffers and Reagents
2:02
Preparation of Samples
2:56
KCl-mediated Depolarization of Isolated Synaptic Terminals
3:21
Fixation and Phalloidin Staining of Samples
4:40
Fluorometric Analysis and Light Scattering
5:20
Data Analysis
6:19
Conclusion
