Name: التزجيج في البويضات الناضجة في المختبر التي تم جمعها من المبيضين الكبار وprepubertal في الأغنام (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: اكتشف بروتوكول تزجيج البويضات الناضجة في المختبر من الأغنام البالغة والصغيرة. تُحسّن إضافة التريهالوز والكالسيوم من بقاء البويضات الصغيرة وقدرتها التنموية بعد التسخين.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ولم يتلق المؤلفان أي تمويل محدد لهذا العمل. البروفسورة ماريا غرازيا كاباي والدكتورة فاليريا باسيو معترف بامتنان لصوت الفيديو ولإعداد المختبر أثناء صنع الفيديو.

<ol><li>Arav, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+oocytes+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of oocytes and embryos.</a> Theriogenology. 81 (1), 96-102 (2014).</li>
<li>Mullen, S. F., Fahy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chronologic+review+of+mature+oocyte+vitrification+research+in+cattle%2C+pigs%2C+and+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">A chronologic review of mature oocyte vitrification research in cattle, pigs, and sheep.</a> Theriogenology. 78 (8), 1709-1719 (2012).</li>
<li>Hwang, I. S., Hochi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+cryopreservation+of+bovine+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Recent progress in cryopreservation of bovine oocytes.</a> BioMed Research International. 2014, (2014).</li>
<li>Berlinguer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+trehalose+co-incubation+on+in+vitro+matured+prepubertal+ovine+oocyte+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification.</a> Cryobiology. 55 (1), (2007).</li>
<li>Quan, G., Wu, G., Hong, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+Cryopreservation+Based+in+Sheep%3A+The+Current+Status+and+Future+Perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreservation+and+Biobanking%22%5BJournal%5D)">Oocyte Cryopreservation Based in Sheep: The Current Status and Future Perspective.</a> Biopreservation and Biobanking. 15 (6), 535-547 (2017).</li>
<li>Succu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recovery+time+after+warming+restores+mitochondrial+function+and+improves+developmental+competence+of+vitrified+ovine+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">A recovery time after warming restores mitochondrial function and improves developmental competence of vitrified ovine oocytes.</a> Theriogenology. 110, (2018).</li>
<li>Succu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+of+in+vitro+matured+ovine+oocytes+affects+in+vitro+pre-implantation+development+and+mRNA+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Vitrification of in vitro matured ovine oocytes affects in vitro pre-implantation development and mRNA abundance.</a> Molecular Reproduction and Development. 75 (3), (2008).</li>
<li>Succu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+Devices+Affect+Structural+and+Molecular+Status+of+In+Vitro+Matured+Ovine+Oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Vitrification Devices Affect Structural and Molecular Status of In Vitro Matured Ovine Oocytes.</a> Molecular Reproduction and Development. 74, 1337-1344 (2007).</li>
<li>Hosseini, S. M., Asgari, V., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic%2C+rather+than+nuclear-DNA%2C+insufficiencies+as+the+major+cause+of+poor+competence+of+vitrified+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+BioMedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic, rather than nuclear-DNA, insufficiencies as the major cause of poor competence of vitrified oocytes.</a> Reproductive BioMedicine Online. , (2015).</li>
<li>Succu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+concentration+in+vitrification+medium+affects+the+developmental+competence+of+in+vitro+matured+ovine+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Calcium concentration in vitrification medium affects the developmental competence of in vitro matured ovine oocytes.</a> Theriogenology. 75 (4), (2011).</li>
<li>Sanaei, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+vitrification+of+in+vitro+matured+ovine+oocytes%3B+beneficial+effects+of+Ethylene+Glycol+Tetraacetic+acid%2C+an+intracellular+calcium+chelator%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">An improved method for vitrification of in vitro matured ovine oocytes; beneficial effects of Ethylene Glycol Tetraacetic acid, an intracellular calcium chelator.</a> Cryobiology. 84, 82-90 (2018).</li>
<li>Quan, G. B., Wu, G. Q., Wang, Y. J., Ma, Y., Lv, C. R., Hong, Q. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+maturation+and+developmental+capability+of+ovine+oocytes+at+germinal+vesicle+stage+following+vitrification+using+different+cryodevices%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Meiotic maturation and developmental capability of ovine oocytes at germinal vesicle stage following vitrification using different cryodevices.</a> Cryobiology. 72 (1), 33-40 (2016).</li>
<li>Fernández-Reyez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((maturation+and+embryo+development+in+vitro+of+immature+porcine+and+ovine+oocytes+vitrified+in+different+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">maturation and embryo development in vitro of immature porcine and ovine oocytes vitrified in different devices.</a> Cryobiology. 64 (3), 261-266 (2012).</li>
<li>Ahmadi, E., Shirazi, A., Shams-Esfandabadi, N., Nazari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidants+and+glycine+can+improve+the+developmental+competence+of+vitrified%2Fwarmed+ovine+immature+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction+in+Domestic+Animals%22%5BJournal%5D)">Antioxidants and glycine can improve the developmental competence of vitrified/warmed ovine immature oocytes.</a> Reproduction in Domestic Animals. 54 (3), 595-603 (2019).</li>
<li>Barrera, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+delipidated+estrous+sheep+serum+supplementation+on+in+vitro+maturation%2C+cryotolerance+and+endoplasmic+reticulum+stress+gene+expression+of+sheep+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Impact of delipidated estrous sheep serum supplementation on in vitro maturation, cryotolerance and endoplasmic reticulum stress gene expression of sheep oocytes.</a> PLoS ONE. 13 (6), (2018).</li>
<li>Walker, S. K., Hill, J. L., Kleemann, D. O., Nancarrow, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Ovine+Embryos+in+Synthetic+Oviductal+Fluid+Containing+Amino+Acids+at+Oviductal+Fluid+Concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Development of Ovine Embryos in Synthetic Oviductal Fluid Containing Amino Acids at Oviductal Fluid Concentrations.</a> Biology of Reproduction. 55 (3), 703-708 (1996).</li>
<li>Kuwayama, M., Vajta, G., Kato, O., Leibo, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+vitrification+method+for+cryopreservation+of+human+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+BioMedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes.</a> Reproductive BioMedicine Online. 11 (3), 300-308 (2005).</li>
<li>Wu, X., Jin, X., Wang, Y., Mei, Q., Li, J., Shi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+spectral+properties+of+novel+chlorinated+pH+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Luminescence%22%5BJournal%5D)">Synthesis and spectral properties of novel chlorinated pH fluorescent probes.</a> Journal of Luminescence. 131 (4), 776-780 (2011).</li>
<li>Dell'Aquila, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prooxidant+effects+of+verbascoside%2C+a+bioactive+compound+from+olive+oil+mill+wastewater%2C+on+in+vitro+developmental+potential+of+ovine+prepubertal+oocytes+and+bioenergetic%2Foxidative+stress+parameters+of+fresh+and+vitrified+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Prooxidant effects of verbascoside, a bioactive compound from olive oil mill wastewater, on in vitro developmental potential of ovine prepubertal oocytes and bioenergetic/oxidative stress parameters of fresh and vitrified oocytes.</a> BioMed Research International. 2014, (2014).</li>
<li>Gadau, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+quantitative+analysis+on+%CE%B1-tubulin+modifications+in+glioblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Morphological and quantitative analysis on α-tubulin modifications in glioblastoma cells.</a> Neuroscience Letters. 687, 111-118 (2018).</li>
<li>los Reyes, M. D., Palomino, J., Parraguez, V. H., Hidalgo, M., Saffie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+distribution+and+meiotic+progression+in+canine+oocytes+during+in+vivo+and+in+vitro+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial distribution and meiotic progression in canine oocytes during in vivo and in vitro maturation.</a> Theriogenology. , (2011).</li>
<li>Leoni, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+kinetic+of+the+first+meiotic+division+and+in+active+mitochondrial+distribution+between+prepubertal+and+adult+oocytes+mirror+differences+in+their+developmental+competence+in+a+sheep+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Differences in the kinetic of the first meiotic division and in active mitochondrial distribution between prepubertal and adult oocytes mirror differences in their developmental competence in a sheep model.</a> PLoS ONE. 10 (4), (2015).</li>
<li>Berlinguer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+trehalose+co-incubation+on+in+vitro+matured+prepubertal+ovine+oocyte+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification.</a> Cryobiology. 55 (1), 27-34 (2007).</li>
<li>Serra, E., Gadau, S. D., Berlinguer, F., Naitana, S., Succu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+features+and+microtubular+changes+in+vitrified+ovine+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Morphological features and microtubular changes in vitrified ovine oocytes.</a> Theriogenology. 148, 216-224 (2020).</li>
<li>Asgari, V., Hosseini, S. M., Ostadhosseini, S., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+dependent+effect+of+post+warming+interval+on+microtubule+organization%2C+meiotic+status%2C+and+parthenogenetic+activation+of+vitrified+in+vitro+matured+sheep+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Time dependent effect of post warming interval on microtubule organization, meiotic status, and parthenogenetic activation of vitrified in vitro matured sheep oocytes.</a> Theriogenology. 75 (5), 904-910 (2011).</li>
<li>Ciotti, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+spindle+recovery+is+faster+in+vitrification+of+human+oocytes+compared+to+slow+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Meiotic spindle recovery is faster in vitrification of human oocytes compared to slow freezing.</a> Fertility and Sterility. 91 (6), 2399-2407 (2009).</li>
<li>Ledda, S., Bogliolo, L., Leoni, G., Naitana, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Coupling+and+Maturation-Promoting+Factor+Activity+in+In+Vitro-Matured+Prepubertal+and+Adult+Sheep+Oocytes1%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Cell Coupling and Maturation-Promoting Factor Activity in In Vitro-Matured Prepubertal and Adult Sheep Oocytes1.</a> Biology of Reproduction. 65 (1), 247-252 (2001).</li>
<li>Palmerini, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+maturation+is+slowed+in+prepubertal+lamb+oocytes%3A+ultrastructural+evidences%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biology+and+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">In vitro maturation is slowed in prepubertal lamb oocytes: ultrastructural evidences.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 12, (2014).</li>
<li>Leoni, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relations+between+relative+mRNA+abundance+and+developmental+competence+of+ovine+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Relations between relative mRNA abundance and developmental competence of ovine oocytes.</a> Molecular Reproduction and Development. 74 (2), 249-257 (2007).</li>
<li>Succu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+vitrification+solutions+and+cooling+upon+in+vitro+matured+prepubertal+ovine+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Effect of vitrification solutions and cooling upon in vitro matured prepubertal ovine oocytes.</a> Theriogenology. 68 (1), 107-114 (2007).</li>
<li>Larman, M. G., Sheehan, C. B., Gardner, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-free+vitrification+reduces+cryoprotectant-induced+zona+pellucida+hardening+and+increases+fertilization+rates+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Calcium-free vitrification reduces cryoprotectant-induced zona pellucida hardening and increases fertilization rates in mouse oocytes.</a> Reproduction. 131 (1), 53-61 (2006).</li>
<li>Yeste, M., Jones, C., Amdani, S. N., Patel, S., Coward, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+activation+deficiency%3A+a+role+for+an+oocyte+contribution%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">Oocyte activation deficiency: a role for an oocyte contribution.</a> Human Reproduction Update. 22 (1), 23-47 (2016).</li>
<li>Rienzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte%2C+embryo+and+blastocyst+cryopreservation+in+ART%3A+systematic+review+and+meta-analysis+comparing+slow-freezing+versus+vitrification+to+produce+evidence+for+the+development+of+global+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance.</a> Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).</li>
<li>De Santis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+vitrification%3A+influence+of+operator+and+learning+time+on+survival+and+development+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Oocyte vitrification: influence of operator and learning time on survival and development parameters.</a> Placenta. 32, 280-281 (2011).</li>
<li>Zhang, X., Catalano, P. N., Gurkan, U. A., Khimji, I., Demirci, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+technologies+in+medical+applications+of+minimum+volume+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Emerging technologies in medical applications of minimum volume vitrification.</a> Nanomedicine. 6 (6), London, England. 1115-1129 (2011).</li>
</ol>

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما مصالح مالية متنافسة.

يمكن أن يسمح الحفاظ على البويضات في الحيوانات المنزلية ليس فقط بالحفاظ على الموارد الوراثية الأنثوية على المدى الطويل ، ولكن أيضا تطوير التكنولوجيات الحيوية الجنينية. وبالتالي، فإن وضع طريقة قياسية لتزجيج البويضات من شأنه أن يستفيد منه كل من الثروة الحيوانية وقطاع البحوث. في هذا البروتوكول، يتم تقديم طريقة كاملة لهزيج البويضات الأغنام الكبار ويمكن أن تمثل نقطة انطلاق صلبة لتطوير نظام كفاءة التزجيج للخلايا ال oocyte الأحداث.
واحدة من المزايا الرئيسية للطريقة المقترحة هي أنها تشمل جميع الخطوات م...

يمكن أن يوفر التخزين طويل الأجل للجامات الأنثوية مجموعة واسعة من التطبيقات ، مثل تحسين تربية الحيوانات المنزلية من خلال برامج الاختيار الجيني ، والمساهمة في الحفاظ على التنوع البيولوجي من خلال برنامج الحفاظ على أنواع الحياة البرية في الموقع السابق ، وتعزيز أبحاث وتطبيقات التكنولوجيا الحيوية في المختبر بفضل توافر البويضات المخزنة التي سيتم دمجها في إنتاج الأجنة المختبرية أو برامج زرع الأعضاء النووية1و2و3. كما أن تزجيج البويضات الأحداث سيزيد من الكسب الوراثي عن طريق تقصير فترة التوليد في برامج التربية4. ويعتبر حاليا التزجيج عن طريق التبريد السريع للغاية والاحترار من البويضات نهجا قياسيا للبويضات الماشية cryopreservation5. في المجترات ، قبل التزجيج ، عادة ما تنضج البويضات في المختبر ، بعد استرجاعها من الجريبات التي تم الحصول عليها من المبيضين المشتقة من المسلخ2. الكبار، وخاصة المبيضين prepubertal4،6، يمكن أن توفر في الواقع عدد غير محدود تقريبا من البويضات لتكون cryopreserved.
في الماشية، بعد التزجيج البويضات والاحترار، وقد تم الإبلاغ عن غلة الكيسة الأريمية في >10٪ عادة من قبل العديد من المختبرات خلال العقد الماضي3. ومع ذلك ، في التزجيج البويضات المجترات الصغيرة لا يزال يعتبر جديدا نسبيا لكل من البويضات الأحداث والكبار ، ولا يزال يتعين إنشاء طريقة قياسية لتزجيج البويضاتالخرافية 2،5. على الرغم من التطورات الأخيرة ، فإن البويضات الزخيفة والدافئ تقدم بالفعل العديد من التعديلات الوظيفية والهيكلية التي تحد من إمكاناتها التنموية7و8و9. وهكذا، ذكرت مقالات قليلة تطوير الكيسة الأريمية في 10٪ أو أكثر في البويضات الأغنام vitrified / الدافئة2. وقد تم بحث عدة نهج للحد من التعديلات المذكورة أعلاه: تحسين تكوين حلول التزجيج والذوبان10،11؛ تجريب استخدام أجهزة التبريد المختلفة8،12،13؛ وتطبيق علاجات محددة أثناء نضوج المختبر (IVM)4و14و15 و / أو خلال فترة النقاهة بعد ارتفاع درجة الحرارة6.
هنا نحن نصف بروتوكولا لتزجيج البويضات الأغنام التي تم جمعها من المتبرعين الأحداث والبالغين ونضجت في المختبر قبل cryopreservation. يتضمن البروتوكول جميع الإجراءات من نضوج البويضات في المختبر إلى التزجيج والاحترار وفترة ثقافة ما بعد الاحترار.

<table><tbody><tr><td>2 & prime ؛ 7 & -ثنائي كلورو فلوريسين ثنائي الأسيتات</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>D-6883</td><td></td></tr><tr><td>جزء الألبومين البقري V ، خالي من البروتياز</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Bisbenzimide H 33342 ثلاثي هيدروكلوريد (Hoechst 33342)</td> <td>سيجما ألدريتش</td><td>14533</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد الكالسيوم (CaCl2 2H20)</td> <td>سيجما ألدريتش</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>حامض الستريك</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2404</td><td></td></tr><tr><td>مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر</td><td></td><td></td> Leica Microsystems GmbH ، Wetzlar TCS SP5 DMI 6000CS <td></td></tr><tr><td>Cryotop Kitazato</td><td>التقنيات البيولوجية الطبية</td> Cysteamine Sigma-Aldrich M9768 D- (-) الفركتوز سيجما ألدريتش F0127 D (+) تجفيف تريهالوز <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>سيجما ألدريتش</td><td>T0167</td><td></td></tr><tr><td>ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)</td> <td>سيجما ألدريتش</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>دولبيكو فوسفات مخزن محلول ملحي</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>صفار البيض</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>P3556</td><td></td></tr><tr><td>إيثيلين جلايكول (EG)</td> <td>سيجما ألدريتش</td><td>324558</td><td></td></tr><tr><td>FSH</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>F4021</td><td></td></tr><tr><td>حمض الجلوتاميك</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>G5638</td><td></td></tr><tr><td>جلوتارالديهايد</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>الجلسرين</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>جلايسين</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>G8790</td><td></td></tr><tr><td>الهيبارين</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>H4149</td><td></td></tr><tr><td>هيبس</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>هيبوتارين</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>H1384</td><td></td></tr><tr><td>مجهر مقلوب</td><td>ديافوت ، نيكون</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-ألانين</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>A3534</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginine</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>A3784</td><td></td></tr><tr><td>L-Asparagine</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>A4284</td><td></td></tr><tr><td>حمض الأسبارتيك</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>A4534</td><td></td></tr><tr><td>L-سيستين</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>L-Cystine</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>C8786</td><td></td></tr><tr><td>L-الجلوتامين</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>LH</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>L6420</td><td></td></tr><tr><td>L-هيستيدين</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>H9511</td><td></td></tr><tr><td>L-Isoleucine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7383</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucine</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>L1512</td><td></td></tr><tr><td>ليسين</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>L1137</td><td></td></tr><tr><td>ل-ميثيونين</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>M2893</td><td></td></tr><tr><td>ل-أورنيثين</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>O6503</td><td></td></tr><tr><td>ل-فينيل ألانين</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>P5030</td><td></td></tr><tr><td>ل-برولين</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>P4655</td><td></td></tr><tr><td>ل-سيرين</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>S5511</td><td></td></tr><tr><td>L-التيروزين</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>T1020</td><td></td></tr><tr><td>L-فالين</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>V6504</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد المغنيسيوم سباعي الهيدرات (MgSO4.7H2O)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Makler Counting Chamber</td><td>Sefi-Medical Instruments Ltd. Biosigma S.r.l.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>متوسط 199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5017</td><td></td></tr><tr><td>زيت معدني</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Red CM-H2XRos</td><td>ThermoFisher</td><td>M7512</td><td></td></tr><tr><td>مصل العجل حديث الولادة معطل بالحرارة (FCS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>N4762</td><td></td></tr><tr><td>البنسلين G ملح الصوديوم</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>الفينول الأحمر</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>كحول البولي فينيل (87-90٪ متحلل ، متوسط مول الوزن 30،000-70،000)</td> <td>سيجما ألدريتش</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد البوتاسيوم (KCl)</td> <td>سيجما ألدريتش</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة (KH2PO4)</td> <td>سيجما ألدريتش</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>بروبيديوم يوديد</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>مصل الأغنام</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>S2263</td><td></td></tr><tr><td>أزيد الصوديوم</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>S2202</td><td></td></tr><tr><td>بيكربونات الصوديوم (NaHCO3) </td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد الصوديوم (NaCl)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>شراب محلول الصوديوم dl-lactate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4263</td><td></td></tr><tr><td>بيروفات الصوديوم</td><td>سيجما-ألدريتش</td><td>P2256</td><td></td></tr> محلل <tr><td>فئة المنوية</td><td>Microptic SL</td><td>S.C.A. v 3.2.0</td><td></td></tr><tr><td>البرامج الإحصائية Minitab 18.1</td><td>2017 Minitab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>مجهر ستيريو</td><td>Olimpus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>كبريتات الستربتومايسين</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9137</td><td></td></tr><tr><td>التورين</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>T7146</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>15،456-3</td><td></td></tr></tbody></table>

التزجيج في البويضات الناضجة في المختبر التي تم جمعها من المبيضين الكبار وprepubertal في الأغنام

Vitrification of In Vitro Matured Oocytes Collected from Adult and Prepubertal Ovaries in Sheep

في الماشية، يمكن تطوير نظم إنتاج الأجنة في المختبر ومواصلة ذلك بفضل العدد الكبير من المبيضين والبويضات التي يمكن الحصول عليها بسهولة من المسلخ. يحمل المبيضان البالغان دائما العديد من بصيلات النمل ، بينما في المتبرعين قبل البلوغ ، تتوفر الأعداد القصوى من البويضات في عمر 4 أسابيع ، عندما يحمل المبيضان أعدادا كبيرة من بصيلات النمل. وهكذا، تعتبر الحملان 4 أسابيع من العمر المتبرعين جيدة، حتى لو كان الكفاءة التنموية للبويضات prepubertal أقل بالمقارنة مع نظيرتها الكبار. 
وستعزز البحوث الأساسية والتطبيقات التجارية بإمكانية نجاح حفظ البويضات الزفيرة التي تم الحصول عليها من المتبرعين البالغين والمتبرعين قبل الاختزال. كما أن تزجيج البويضات التي يتم جمعها من المتبرعين قبل التكاثر سيسمح بتقصير فترة التوليد وبالتالي زيادة المكاسب الوراثية في برامج التربية. ومع ذلك ، فإن فقدان إمكانات النمو بعد التبريد يجعل البويضات الثديية على الأرجح واحدة من أصعب أنواع الخلايا للحفاظ على التبريد. من بين تقنيات التبريد المتاحة ، يتم تطبيق التزجيج على نطاق واسع على البويضات الحيوانية والبشرية. على الرغم من التطورات الأخيرة في هذه التقنية ، فإن التعرض لتركيزات عالية من العوامل الصفية المبردة وكذلك الإصابة المخيفة والإجهاد التناضحي لا يزال يحفز العديد من التعديلات الهيكلية والجزيئية ويقلل من الإمكانات التنموية للبويضات الثديية. هنا، نقوم بوصف بروتوكول لتزجيج البويضات الخرافية التي تم جمعها من المتبرعين الأحداث والبالغين ونضجت في المختبر قبل التبريد. ويشمل البروتوكول جميع الإجراءات من البويضات في النضج في المختبر إلى التزجيج والاحترار وفترة الحضانة بعد الاحترار. يمكن بالفعل تخصيب البويضات المهزوسة في مرحلة MII بعد الاحترار ، ولكنها تحتاج إلى وقت إضافي قبل الإخصاب لاستعادة الضرر بسبب إجراءات التبريد وزيادة إمكاناتها التنموية. وبالتالي، فإن ظروف الثقافة والتوقيت بعد الاحترار هي خطوات حاسمة لاستعادة إمكانات نمو البويضات، خاصة عندما يتم جمع البويضات من المتبرعين الأحداث.

والتبريد من البويضات من المتبرعين الأحداث أقل بالمقارنة مع الكبار. التأثير الأول الملاحظ هو انخفاض معدل البقاء على قيد الحياة بعد الاحترار مقارنة بالبويضات البالغة(الشكل 1A؛ خي2 اختبار P&lt;0.001). وأظهرت البويضات الأحداث سلامة الغشاء أقل بعد الاحترار (الشكل 1B). كان الغرض من استخدام التريهالوز في وسط النضج هو التحقق مما إذا كان هذا السكر يمكن أن يقلل من إصابات التبريد في البويضات الصغيرة. وقد أظهرت البيانات23 أن البويضات نضجت ...

ويهدف البروتوكول إلى توفير طريقة قياسية لتزجيج البويضات الأغنام البالغة والحدث. وهو يشمل جميع الخطوات من إعداد وسائل الإعلام النضج في المختبر لثقافة ما بعد الاحترار. يتم تزجيج البويضات في مرحلة MII باستخدام Cryotop لضمان الحد الأدنى من الحجم الأساسي.

In livestock, in vitro embryo production systems can be developed and sustained thanks to the large number of ovaries and oocytes that can be easily ...

ويمثل الحفاظ على إمكانية بقاء البويضات بعد التخزين على المدى الطويل أداة لفرصة عظيمة، لأنه من شأنه أن يحسن تربية الحيوانات المنزلية من خلال برامج الانتقاء الجيني، ويساهم في الحفاظ على التنوع البيولوجي من خلال الحفاظ على أنواع الحياة البرية، ويزيد من البحوث في مجال التكنولوجيا الحيوية. كان تزجيج البويضات الأحداث أقصر بكثير في فترة الجيل في برامج التربية. يعتبر Vitrifaction عن طريق التبريد والاحترار ultrarapid نهجا قياسيا في الحفاظ على البويضات الماشية.ومع ذلك، في الأغنام هذا الإجراء لا يزال يعتبر جديدا نسبيا، وهناك نقص في طريقة قياسية. في هذا الفيديو، نقوم بوصف بروتوكول لتزجيج البويضات الخرافية، التي تم جمعها من المتبرعين الأحداث والبالغين على حد سواء، وفي المختبر نضجت إلى ما قبل التبريد. يتضمن البروتوكول جميع الإجراءات من النضج في المختبر ، والتزجيج ، والاحترار ، وثقافة ما بعد الاحترار.بعد استعادة مجمع البويضات الركامية ، حيث نضجت في المختبر لمدة 24 ساعة في حالة ثابتة تشمل البويضات الأحداث ، والتكميل مع مائة ميكرومولار من تريهالوز في وسط النضج. بعد النضج في المختبر ، تم تجني البويضات من خلايا Cumulus ميكانيكيا عن طريق الأنابيب بلطف وفحصها تحت المجهر ستيريو ، مع تكبير 60x. اختيار البويضات لتقديم في إجراءات التزجيج تمثل الخطوة الهامة الأولى لضمان التطبيق الناجح لهذا الإجراء.فقط تلك مع السيتوبلازم موحدة، مع توزيع متجانسة من قطرات الدهون، وسلامة كل إيما واسعة ومحورية مستمرة في الفضاء، زونا بيلوسيدا المدمجة القطر الخارجي من حوالي 19 ميكرومتر وإظهار البثق من الجسم القطبي الأول، وبالتالي في M2، يجب اختيار المرحلة. تم إجراء التزجيج باستخدام الحد الأدنى من طريقة الحجم الأساسية ، مع جهاز Cryotops. بعد الاختيار، تم تكييف مجموعة من خمس بويضات الأحداث في 38.5 درجة مئوية في الوسط الأساسي لمدة دقيقتين.ثم تم جفاف البويضات من قبل ثلاث دقائق التعرض لمحلول المعايرة. تحميل البويضات في جهاز التزجيج المستخدمة هو خطوة هامة وحاسمة. يستخدم Cryotop شريط البولي بروبلين المرفق بحامل.في هذه الطريقة ، يتم تحميل البويضات في محلول التزجيج ، أقل من 0 ملليلتر نقطة بسرعة مع شعرية زجاجية فوق شريط الفيلم. ثم يجب إزالة الحل، تاركا وراءه طبقة رقيقة بما يكفي لتغطية الخلايا لتكون cryopreserved. قبل تحميلها في جهاز Cryotop وسقطت مباشرة في النيتروجين السائل في غضون 30 ثانية.بالنسبة لدرجة الحرارة البيولوجية الداخلية الدافئة ، تم نقل محتوى كل جهاز تزجيج من النيتروجين السائل إلى 200 قطرة ميكرولتر من محلول تريهالوز المتناقص. تم نقل البويضات مجموعة، وسحب البويضات مع رقيقة، ماصة زجاجية، لتعزيز إزالة cryoprotectants داخل الساقين. وأخيرا، كانت البويضات تولد مسبقا في وسط أساسي في حاضنة بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.مباشرة بعد الاحترار، ولكل نقطة زمنية من ثقافة ما بعد الاحترار، تم تقييم البويضات بشكل مورفولوجي باستخدام مجهر مقلوب مع تكبير 100x. التسامح cryo من البويضات من المتبرعين الأحداث أقل بالمقارنة مع تلك المعدلة مع انخفاض سلامة الغشاء بعد الاحترار. استخدام تريهالوز في المتوسط النضج الناجم في البويضات الأحداث أعلى سلامة الغشاء، وزيادة معدلات البقاء على قيد الحياة بعد التزجيج.ومع ذلك لم يتم زيادة الانقسام والإخصاب ومعدلات النمو للخلايا البويضات الأحداث عن طريق مكملات تريهالوز. استخدام وسائل الإعلام مع تركيز الكالسيوم يساوي 2.2 ملليغرام ديسيلتر لتزجيج البويضات الأحداث، ينبغي أن معدلات الإخصاب أعلى مقارنة مع البويضات تهتز مع تركيز الكالسيوم، ولكن لم يتم العثور على اختلافات تمكين الإنتاج. من خلال مقارنة ثقافة ما بعد الاحترار على فترات مختلفة ، أظهرنا أنه بعد أربع ساعات من البويضات الثقافية التي تم جمعها من اثنين أكبر سنا قادرون على استعادة الروابط النشطة والإعداد المجهري ، واستعادة الكفاءة التنموية مع ارتفاع الانقسام ونفايات الخلايا الانفجارية.كان نشاط الميتوكوندريا أعلى في البويضات الدافئة الزخورة بعد أربع ساعات من ثقافة ما بعد الاحترار ، مقارنة بالنقاط الزمنية الأخرى. كما تغير فراق توزيع الميتوكوندريا خلال ست ساعات من ثقافة ما بعد الاحترار. وعلاوة على ذلك، كانت مستويات الأكسجين التفاعلي داخل الخلايا أقل بكثير في البويضات الأحداث في ساعتين من ثقافة ما بعد الاحترار مقارنة مع 0 و 4 و 6 ساعات.ومع ذلك ، وعلى النقيض مما وجد في البويضات الأخرى ، زادت معدلات التنشيط الذاتي البارثينوجيني خلال ثقافة ما بعد الاحترار في البويضات الأحداث. واحدة من المزايا الرئيسية للطريقة المقترحة هي أنها تشمل جميع الخطوات من جمع البويضات إلى النضج في المختبر ، والتزجيج ، والاحترار. وعلاوة على ذلك فإنه يتضمن فترة ثقافة ما بعد الاحترار للسماح باستعادة البويضات من الأضرار التي لحقت أثناء إجراء التزجيج.اختيار الوقت الأمثل للإخصاب أمر صعب، وقد يؤثر على نتيجة برنامج التزجيج. وينبغي أيضا اعتبار أن التزجيج، خلافا لبطء التجميد، تقنية يدوية، وبالتالي فهو يعتمد على المشغل. ولهذا السبب، يتمثل أحد التحديات الرئيسية في الحاجة إلى فنيين وباحثين مهرة يأخذون في الاعتبار تأثير المشغل في تقييم نتائج برنامج التزجيج.المزيد من الدراسات من مختبرنا سوف تسمح في محاولة لتوحيد إجراء التزجيج البويضات والاختيار، وفي تحسين تصميم وسائل الإعلام التكوين لاحتياجات البويضات الأحداث. تجاهل حول استخدام الثقافة والشخصية ومضادات الأكسدة نقدم فرصا واعدة.

vitrification-vitro-matured-oocytes-collected-from-adult-prepubertal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

علم الأحياء النمائي

تصف هذه المخطوطة نهجا تجريبيا لتوصيف البويضات الحصانية شكليا وبيولوجيا كيميائيا. على وجه التحديد، ويوضح العمل الحالي كيفية جمع البويضات الحصان غير ناضجة وناضجة عن طريق الموجات فوق الصوتية الموجهة البيك البيك اب (أوبو) وكيفية التحقيق الفصل الكروموسوم، مورفولوجيا المغزل، هيستون العالمية هيستيون، والتعبير مرنا.

تحليل فصل الكروموسوم، هيستون أستيلاتيون، و مورفولوجيا المغزل في البويضات الحصان

هنا هي بروتوكولين لتغليف البويضات porcine في ظروف ثقافة 3D. في الأول، يتم تغليف مجمعات الزُنَق (COCs) في الخرز الفيبرين-الجينات. وفي الثانية، يتم وضعها مع جزيئات مسحوق البروبيلين الإيثيلين المفلورة (ميكروبيراكات). يضمن كلا النظامين الظروف المثلى للحفاظ على تنظيمهما ثلاثي الأبعاد.

تحلل Proteolytically Alginate Hydrogels والميكروبات الهيدروفوبية ل Porcine Oocyte تغليف

تصف هذه المخطوطة بروتوكولاً للحد الأدنى من الانبعاثات البويضية غير الناضجة من البويضات القطة مع وسائل الإعلام المختبرية الصنع على الدعامات التجارية. وهو يغطي كل خطوة من عزل البويضات من الزناد السابقين vivo إلى التزجيج والاحترار.

الحد الأدنى من حجم الحساسية من البويضات غير ناضجة القطط

نحن نصف إجراءات عزل البويضات المتنامية من بصيلات المبيض في المراحل المبكرة من التطور ، وكذلك إعداد نظام ثقافة في المختبر يمكن أن يدعم النمو والتمايز حتى المرحلة الكاملة النمو.

في استراتيجية ثقافة فيترو لبويضات من أوائل الجريب الأنترال في الماشية

يعترف العديد من الجمعيات العلمية الدولية بالتبريد البويضات كمعيار ذهبي للحفاظ على الخصوبة لدى النساء بعد الولادة. تضمن الاستراتيجيات السريرية والمختبرية المناسبة أقصى قدر من الفعالية والكفاءة والسلامة لعلاجات الحفاظ على الخصوبة.

الحفاظ على الخصوبة من خلال التزجيج Oocyte: المنظورات السريرية والمختبرية

يتم تقديم بروتوكول لتزجيج أنسجة المبيض ، كطريقة بديلة للحفظ بالتبريد لبروتوكول التجميد البطيء المستخدم على نطاق واسع.

تزجيج أنسجة قشرة المبيض لتحقيق حالة زجاجية من التراكم

هنا ، نقدم بروتوكول ملعقة مونتيفيديو لتزجيج أجنة الفئران والأغنام قبل الزرع ، والتي تتكون من ملعقة محلية الصنع وتستخدم محاليل محلية الصنع. يتم موازنة الأجنة بسرعة في محلولين بالتبريد بتركيز متزايد ، ويتم تحميلهما على الملعقة ، وغمرهما في النيتروجين السائل ، وأخيرا مختومة بقش 0.5 مل.

جهاز ملعقة مونتيفيديو لتزجيج أجنة الثدييات

يحدد هذا البروتوكول طرقا موحدة لعزل ومعالجة السائل المسامي والخلايا الجسدية والبويضات غير الناضجة من إجراءات التلقيح الاصطناعي ، مما يتيح التحليلات الجزيئية والخلوية عالية الجودة. تدعم هذه الأساليب البحث الانتقالي في الخصوبة والشيخوخة الإنجابية وضعف المبيض باستخدام المواد التي يتم التخلص منها عادة في الرعاية السريرية.

جمع السائل المسامي البشري والخلايا الجسدية للجريب والبويضات غير الناضجة من الأفراد الذين يخضعون للتخصيب في المختبر

نصف طرق التلاعب بالبويضات غير الناضجة Xenopus laevis ، والنضج المختبري للبويضات إلى البويضات ، وحقن المنوية داخل الهيولى. يسمح هذا البروتوكول بتدهور بعض بروتينات الأم والإفراط في التعبير عن الجينات ذات الأهمية عند الإخصاب ، وبالتالي فهو ذو قيمة لدراسة أدوار عوامل محددة في التطور الجنيني المبكر.

التلاعب و<em&gt; في المختبر</em&gt; نضوج<em&gt; القيطم المورق</em&gt; البويضات، تلاه سهم داخل الهيولى حقن الحيوانات المنوية، لدراسة التطور الجنيني

في المقايسات مستعمرة المختبر للكشف عن تجديد الذات والتمايز للخلايا السلف عزل من البنكرياس الفئران الكبار وضعها. في هذه المقايسات، الأسلاف البنكرياس تؤدي إلى مستعمرات الخلايا في الفضاء 3 الابعاد في المتوسطة التي تحتوي على ميثيل شبه صلبة. ووصف بروتوكولات للتعامل مع الخلايا وحيدة وتوصيف المستعمرات الفردية.

في المختبر مستعمرة فحوصات للتميز الخلايا السلف ثلاثي قوية المعزولة من الفئران البنكرياس الكبار

اكتشف بروتوكول تزجيج البويضات الناضجة في المختبر من الأغنام البالغة والصغيرة. تُحسّن إضافة التريهالوز والكالسيوم من بقاء البويضات الصغيرة وقدرتها التنموية بعد التسخين.

التزجيج في البويضات الناضجة في المختبر التي تم جمعها من المبيضين الكبار وprepubertal في الأغنام

استكشف المزيد من الفيديوهات