طريقة تلقيح سهلة ومرنة لتقييم الأنماط الظاهرية لعدوى البياض الدقيقي للأرابيدوبسيس والنباتات الأخرى بدقة

البياض الدقيقي هو مرض نباتي مهم. يتطلب التحديد الدقيق للنمط الظاهري للمرض حتى تلقيح العامل الممرض. نظرا لأن الأساليب الحالية غير فعالة ، فقد طورنا هذا البروتوكول.

يمكن لطريقة تلقيح البوغ لدينا أن تحقق بسهولة تلقيحا متساويا ، وهي بسيطة وقابلة للتطوير. وبالتالي ، يمكن لأي مختبر يعمل مع البياض الدقيقي استخدام هذه الطريقة بسهولة. يمكن للباحثين أيضا تركيب شبكة فوق صندوق من الورق المقوى واستخدامه لتلقيح البوغ.

تعد كيفية إزاحة الجراثيم وتنظيفها من خلال الشبكة خطوة حاسمة. لذا فإن إظهار هذا على الفيديو قد يكون مفيدا للغاية. لهذا البروتوكول ، احصل على لفة من شبكة غشاء نايلون 50 ميكرومتر أو شبكة من الفولاذ المقاوم للصدأ 48 ميكرومتر.

قطع الخشب الرقائقي كبير الحجم ومتوسط الكثافة إلى قطع من 24.5X10 بوصة و 12X10 بوصة لصنع صندوق تلقيح. لعمل غطاء علوي قابل للإزالة بشبكة ، قم بقص وتد خشبي مربع طويل إلى مجموعتين من 26 بوصة و 12.75 بوصة. الغراء والأظافر أربع قطع لتناسب حول مربع.

خذ صفائح الأكريليك وقم بتجميع جميع ألواح الأكريليك في صندوق ، باستخدام ثمانية مشابك زاوية. قم بقص نافذة فتح مقاس 7 × 2 بوصة على الجانب الأمامي من لوح الأكريليك في الصندوق. لتحضير جراثيم البياض الدقيقي الطازجة كلقاح ، قم بزراعة نباتات متحولة نظيفة من مادة Arabidopsis ضعيفة المناعة 4-1 في غرفة نمو عند 22 درجة مئوية ورطوبة نسبية بنسبة 65٪ لمدة ستة إلى ثمانية أسابيع.

قم بزراعة النباتات لتحديد الأنماط الظاهرية للعدوى في الشقق القياسية. قم بتلقيح واحد أو نصف نباتات pad4-1 لبناء جراثيم البياض الدقيقي الطازجة الكافية. عندما تتوفر جراثيم جديدة من النباتات المصابة ، انقل شقة من النباتات إلى صندوق التلقيح داخل غرفة التلقيح لاختبار العدوى.

قطع 15 إلى 20 ورقة أرابيدوبسيس شديدة العدوى ، واتركها تجف إذا كان هناك ماء مكثف. امسك ورقة أو ورقتين رأسا على عقب بيد واحدة باستخدام ملقط طويل. ثم ضع كلتا يديك من خلال فتحة الغرفة وضرب ذراع الملقط برفق بمقص ، مع تحريك الأوراق ببطء فوق الشبكة المثبتة على صندوق التلقيح.

قم بتنظيف الجراثيم بفرش خلاط مروحة دقيقة عبر سطح الشبكة بالكامل في اتجاهات مختلفة لزيادة التوزيع المتساوي للجراثيم على النباتات. ربت برفق على الشبكة عدة مرات بالفرش للتخلص من الجراثيم العالقة في الشبكة. بمجرد أن تستقر الجراثيم ، اخرج الشقة التي تحتوي على النباتات الملقحة من صندوق التلقيح.

قم بتغطية الشقة بقبة بلاستيكية وضعها في غرفة نمو عند 22 درجة مئوية ورطوبة نسبية 65٪. يمكن إجراء التنميط الظاهري للمرض في 5 أو 8 إلى 12 يوما بعد التلقيح. قم بتحويل صناديق الكرتون إلى صندوق تلقيح عن طريق إزالة الجانبين العلوي والسفلي للصندوق ، ولصق الزاوية لتثبيته ، وتركيب شبكة 50 ميكرومتر في الأعلى بالغراء.

حرك الشقة التي تحتوي على النباتات داخل غرفة التلقيح ، وضع صندوق التلقيح الأصغر أعلى الشقة لتغطية النباتات. ثم قم بإزاحة الجراثيم وتنظيفها. اصنع صندوق تلقيح صغير أكبر قليلا من طبق بتري.

قم بتخزين الأطباق على حرارة أربع درجات مئوية في الثلاجة حتى الاستخدام. قطع واحد أو اثنين من الأوراق الموسعة بالكامل من قاعدة سويقة لكل نبات ليتم اختباره. أدخل سويقات الأوراق المنفصلة في وسط أجار بزاوية 30 درجة.

تلقيح الأوراق داخل غرفة التلقيح ، وحرك اللوحة مع الغطاء إلى غرفة النمو. لتقييم الأنماط الظاهرية للعدوى ، انقل الأوراق إلى صفيحة أجار MS معقمة جديدة بعد أربعة أو خمسة أيام من التلقيح. قطع قاعدة السويقة قبل إدخال الأوراق في وسط أجار طازج.

تقييم الأنماط الظاهرية للمرض في ثمانية أو تسعة أيام بعد التلقيح. أظهر التحليل المجهري توزيعا متساويا للجراثيم على الشرائح المجهرية في الجزء السفلي من الشقة. لم تظهر الكثافة المحسوبة للجراثيم ، الموزعة في ستة مواقع مختلفة بعد التلقيح الضوئي ، أي فروق ذات دلالة إحصائية.

تم تحقيق نتائج مماثلة بعد التلقيح المكثف بالجراثيم. تم فحص تساوي التلقيح بين الأنماط الوراثية النباتية المختلفة بعد 12 يوما من التلقيح الكثيف. أظهرت نباتات pad4-1 قابلية معززة للإصابة بالأمراض مقارنة بكولومبيا 0 ، النباتات البرية.

من المهم استخدام جراثيم طازجة كافية ، يتم إنتاجها بعد حوالي 10 أيام من التلقيح ، على النباتات الحساسة ، لأن الجراثيم الطازجة أسهل في إزاحتها وأكثر عرضة لتأسيس الاستعمار. البياض الدقيقي يستعمر فقط خلايا البشرة النباتية. إن عزل الخلايا المصابة بالبياض الدقيقي عن طريق تقشير البشرة ، أو التشريح الدقيق بالليزر ، من شأنه أن يمكن من إجراء دراسة نسخية وبروتينية أكثر استهدافا لاستجابات المضيف.

ستساعد هذه الطريقة الباحثين على تحديد الأنماط الظاهرية لعدوى البياض الدقيقي بشكل أكثر كفاءة ، وبالتالي يجب أن تسهل إجراء دراسات وظيفية أكثر فعالية على تفاعلات البياض الدقيقي للنبات.