المجهر المسح الضوئي بالليزر البؤري لديناميكيات الكالسيوم في شرائح أنسجة البنكرياس الحادة للفأر

بالاقتران مع تصوير الكالسيوم في الخلايا الحية ، تمكن تقنية شريحة أنسجة البنكرياس الحادة من دراسة الموجات بين الخلايا والاتصال الوظيفي متعدد الخلايا بدقة عالية على مدى فترات زمنية طويلة. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أنها سريعة ، وتحافظ على بنية الأنسجة ، وتقلل من الإجهاد الأنزيمي والميكانيكي المحدود مع الحفاظ على إنتاجية عالية من الأنسجة. من خلال الكشف عن التغيرات الوظيفية والمورفولوجية أثناء تطور المرض ، تساعد هذه التقنية في فهمنا للأمراض المرتبطة بالبنكرياس ، مثل مرض السكري.

يمكن تطبيق تقنية شرائح الأنسجة هذه على أنسجة الدماغ والغدة النخامية والغدة الكظرية مع التركيز على الحفاظ على الاتصال بين الخلايا وتفاعلات الباراكرين وبنية الأنسجة. للتحضير لحقن الأغاروز في بنكرياس الفأر ، املأ حقنة سعة خمسة ملليلتر بأغاروز سائل 40 درجة مئوية وقم بتجهيز المحقنة بإبرة قياس 30. بعد تغطية الإبرة بعناية بغطاء ، ضع نهاية إبرة المحقنة لأسفل ، مع كامل حجم الأغاروز تحت سطح الماء ، في حمام مائي 40 درجة مئوية.

فقاعة زجاجة من محلول خارج الخلية مع الكربوجين ، باستمرار على الجليد ، بمعدل 1.5 ملليلتر في الدقيقة عند الضغط الجوي ودرجة حرارة الغرفة لضمان الأوكسجين ودرجة الحموضة 7.4. لإجراء حقن الأغاروز ، ضع فأرا بالغا تم قتله الرحيم تحت مجهر ستيريو والوصول إلى بطن الفأر عبر بضع البطن. حرك الأمعاء برفق إلى الجانب الأيسر لفضح القناة الصفراوية الشائعة واستخدم الملقط لرفع الطرف الاثني عشر للقناة قليلا لتحديد موقع حليمة فاتر.

استخدم مرقئ لتثبيت القناة الصفراوية في الحليمة الاثني عشر لمنع تسرب الأغاروز من القناة إلى الاثني عشر واستخدم ملقطا حادا صغيرا للوصول إلى أسفل القناة الصفراوية الشائعة لكسر الغشاء الذي يربط القناة بأنسجة البنكرياس. بعد إزالة أكبر قدر ممكن من الدهون والنسيج الضام من القناة ، ضع القناة بشكل عمودي على أطراف زوج من الملقط الأكبر ، واضغط بقوة على مكبس المحقنة ، وحقن الأغاروز السائل اللزج في الطرف القريب من القناة الصفراوية المشتركة لمدة 20 إلى 30 ثانية. عندما يصبح النسيج أبيض ومنتفخا قليلا ، قم بإزالة المحقنة وصب ببطء 20 ملليلتر من محلول الثلج البارد خارج الخلية على البنكرياس لتبريد الأنسجة وتصلب الأغاروس.

للحصول على شرائح أنسجة البنكرياس ، استخدم الملقط والمقص الناعم المقطوع لنقل البنكرياس المحقون بالأغاروز بلطف إلى طبق بتري 100 ملم يحتوي على 40 ملليلتر من محلول خارج الخلية البارد المثلج. قم بتدوير الطبق لشطف الأنسجة ونقل البنكرياس إلى طبق ثان من محلول خارج الخلية بارد مثلج. استخدم الملقط والمقص لقطع قسم البنكرياس الأبيض المحقون جيدا إلى ما يصل إلى ست قطع من 0.1 إلى 0.2 سنتيمتر مكعب وإزالة أي أنسجة ضامة ودهنية متبقية من قطع الأنسجة.

ضع الكتل النظيفة في طبق بتري سفلي غير لزج 35 ملم يحتوي على ما يقرب من خمسة ملليلترات من الأغاروز السائل 40 درجة مئوية وضع طبق بتري على الفور على الجليد. عندما يتصلب الأغاروز ، أمسك طبق بتري رأسا على عقب فوق غطاء طبق بتري 100 ملم واستخدم نصف شفرة حلاقة لقطع الهامش بعناية بين الجدار الجانبي لطبق بتري والأغاروز لإزالة الأغارو من الطبق. استخدم شفرة الحلاقة لقطع مكعبات فردية ، يحتوي كل منها على كتلة نسيج واحدة من الأغاروز ، من الأغاروز المحرر واستخدم غراء سيانو أكريليت لربط الكتل بلوحة عينة من الاهتزاز.

املأ غرفة القطع في الاهتزاز ب 150 ملليلتر من محلول خارج الخلية البارد المثلج باستمرار مع الكربوجين. قم بتثبيت لوحة العينة على الاهتزاز وقم بتركيب شفرة حلاقة جديدة. أحط الغرفة بالثلج وأضف مكعبي ثلج بحجم 10 ملليلتر مصنوعين من محلول خارج الخلية مكمل بستة ملليمولات جلوكوز.

اضبط القطاعة على 0.05 إلى 1 ملليمتر في الثانية و 70 هرتز ، ثم ابدأ في التقطيع للحصول على شرائح أغاروز سميكة 140 ميكرون بمساحة سطح تتراوح من 20 إلى 100 ملليمتر مربع. استخدم فرشاة طلاء ناعمة لنقل كل شريحة بعناية إلى طبق بتري 100 ملم مملوء ب 40 ملم من مخزن HEPES العازل مع ستة ملليمولات من الجلوكوز. لإعداد صبغة الكالسيوم ، قم بإذابة 50 ميكروغرام من صبغة مؤشر الكالسيوم القابلة للنفاذ الخلوي ، و 7.5 ميكرولتر من DMSO ، و 2.5 ميكرولتر من poloxamer ، و 6.667 ملليلتر من HBS في أنبوب غطاء لولبي 15 ملليلتر.

استخدم ماصة لخلط المحلول جيدا لمدة 20 ثانية قبل غمر الأنبوب في غرفة حمام بالموجات فوق الصوتية والدوامة ، كل منها لمدة 30 ثانية. ثم أليكوت 3.333 ملليلتر من محلول صبغة مؤشر الكالسيوم الناتج في طبق بتري واحد 5 ملليلتر لكل 10 شرائح من الأنسجة ليتم وضع علامة عليها. لتحميل الصبغة، استخدم فرشاة طلاء ناعمة رقيقة لنقل ما يصل إلى 10 شرائح أنسجة إلى كل طبق من محلول الصبغة ووضع الأطباق على شاكر مداري لمدة 50 دقيقة في درجة حرارة الغرفة و 40 دورة في الدقيقة محمية من الضوء.

في نهاية الحضانة ، انقل ما يصل إلى 20 شريحة ملطخة إلى أطباق بتري فردية سعة 60 ملليلتر مليئة ب HBS الخالي من الصبغات. بالنسبة لتصوير الكالسيوم بواسطة المجهر البؤري ، حدد تكبيرا 20 أو 25 مرة واضبط وضع الاكتساب على التصوير بفاصل زمني ، والثقب إلى 100 إلى 200 ميكرون ، والإثارة والانبعاثات للفلوروفور المستخدم في التجربة. قم بتركيب غرفة التسجيل ونظام التروية على المرحلة التي يتم التحكم في درجة حرارتها من المجهر ووضع المدخل والمخرج على الحواف البعيدة لغرفة التسجيل.

اضبط معدلات التدفق الداخلة والخارجة على واحد إلى ملليلتر في الدقيقة. اضبط درجة حرارة نظام الغزير على 37 درجة مئوية وابدأ الوفرة باستخدام المحلول غير المحفز. لتسجيل ديناميكيات الكالسيوم في الأنسجة ، ضع شريحة نسيج واحدة في غرفة التسجيل وشل حركة الأنسجة بوزن بلاتيني على شكل حرف U مع شبكة نايلون مشدودة.

استخدم خيار المجال الساطع لتحديد موقع الهيكل محل الاهتمام واستخدم التصوير الحي لوضع الهياكل المدروسة في مجال الرؤية. لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء، اضبط طاقة الليزر، وتضخيم الكاشف، وربط متوسط الخط مع الحفاظ على الحد الأدنى من طاقة الليزر. اضبط المستوى البؤري على 15 ميكرون تحت السطح المقطوع لتجنب التسجيل من الخلايا التي يحتمل أن تكون تالفة والحصول على الصور.

ضبط تردد أخذ العينات على واحد إلى هيرتز للسماح بالكشف الأولي عن التذبذبات الفردية وتسجيل صورة عالية الدقة. إذا كان ذلك متاحا، استخدم مخططا عبر الإنترنت للحصول على ملاحظات فورية حول استجابة التحضير، والإضاءة الزائدة، والتبييض الضوئي، والانجراف الميكانيكي. عند الحصول على جميع الصور، احفظ البيانات لتحليلها لاحقا.

هنا يمكن ملاحظة مثال على شريحة الأنسجة المثلى التي تم فيها تحميل صبغة مؤشر الكالسيوم القابلة للنفاذ إلى الخلية بنجاح في شريحة أنسجة البنكرياس. في المقابل ، فإن شرائح الأنسجة هذه ليست مثالية للتصوير إما بسبب اختراق الصبغة غير الناجح ، أو نقص الخلايا الجزرية ، أو وفرة الأنسجة الميتة على سطح العينات. يمكن استخدام صور عالية الدقة لشريحة أنسجة البنكرياس لتحديد مناطق متميزة من أنسجة البنكرياس ، مثل جزر لانغرهانز أو أنسجة الأسينار أو قناة البنكرياس.

يمكن استخدام المحفزات للتمييز وظيفيا بين الخلايا الجزرية المختلفة أو بين الخلايا الجزرية وغير الجزرية. على سبيل المثال، تستجيب خلايا بيتا عادة لتحفيز الجلوكوز النبضي المربع من خلال إظهار زيادة عابرة في الكالسيوم داخل الخلايا تليها تذبذبات الكالسيوم السريعة على هضبة مستدامة. في المقابل، تستجيب الخلايا غير بيتا بتذبذبات أسرع وأكثر انتظاما.

يمكن أيضا قياس التأخير في ظهور زيادة الكالسيوم داخل الخلايا بعد التحفيز ، وكذلك عدم التجانس والتأخير بين الخلايا الفردية. يمكن استخدام نفس المعلمات لوصف مرحلة إلغاء التنشيط. هنا يمكن ملاحظة عرض تخطيطي لمدة تذبذب الكالسيوم داخل الخلايا وتواترها والنسبة المئوية للوقت النشط.

عند التصوير بمعدلات اكتساب أكبر من 10 هرتز ، يمكن التعرف بوضوح على موجات الكالسيوم التي تنتشر بشكل متكرر عبر الجزيرة. قم بتثبيت القناة الصفراوية المشتركة بالقرب من الاثني عشر قدر الإمكان لمنع انسداد الفرع الذي يدخل البنكرياس عن طريق الخطأ. أيضا ، لا تتوقف عن اكتئاب المكبس أثناء الحقن لأن الأغاروز سوف يتصلب على الفور في الإبرة.

يمكن أيضا استخدام تقنية شريحة أنسجة البنكرياس الحادة للفأر مع طريقة مشبك التصحيح لدراسة تيارات القناة الأيونية والوصول إلى الخلايا وكذلك دراسات الكيمياء النسيجية المناعية ودراسات السكرتارية.