بروتوكولات تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمية لقطرات النسخ العكسي المكونة من خطوتين للكشف عن SARS-CoV-2 وقياسه

يمكن استخدام هذه البروتوكولات لتطوير مقايسات ddPCR متعددة الإرسال الداخلية للكشف عن SARS-CoV-2 باستخدام نظام ddPCR بلونين. هذا مفيد للأشخاص الذين يرغبون في تطوير مجموعاتهم الخاصة للكشف عن SARS-CoV-2 ومسببات الأمراض الأخرى. بالمقارنة مع المعيار الذهبي RT-qPCR ، يمكن استخدام RT-ddPCR لتحديد جينات SARS-CoV-2 المتعددة دون الحاجة إلى منحنى قياسي.

نظرا لأن ddPCR هي تقنية ناشئة ، فإن العرض المرئي مهم لمساعدة المستخدمين الحاليين والمستقبليين على فهم وتطوير مقايسات متعددة الإرسال بسهولة للكشف عن SARS-CoV-2 ومسببات الأمراض الأخرى. لتخليق cDNA ، أضف ميكرولتر من المزيج الرئيسي للنسخ العكسي 5X ، وخمسة ميكرولترات من عينة الحمض النووي الريبي ذات الأهمية ، وثلاثة ميكرولترات من الماء المقطر المزدوج الخالي من RNase في أنبوب PCR 100 أو 200 ميكرولتر إلى حجم نهائي يبلغ 10 ميكرولتر كمحلول ، وضع الأنبوب على الجليد. عند إضافة الكواشف ، قم بتحميل العينة في دورة حرارية واضبط الأداة لتشغيل النسخ العكسي عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، وتعطيل الحرارة للنسخ العكسي لمدة 5 ثوان عند 85 درجة مئوية ، وعقد نهائي لانهائي عند أربع درجات مئوية.

قبل إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي بالقطرات ، أضف 19.8 ميكرولترا من المزيج الرئيسي المعد حديثا إلى العدد المناسب من الآبار للوحة PCR الرقمية الخالية من النيوكلياز المكونة من 96 بئرا. أضف 2.2 ميكرولتر من cDNA إلى كل بئر من المزيج الرئيسي إلى حجم نهائي يبلغ 22 ميكرولترا من مزيج التفاعل لكل بئر وأغلق اللوحة باستخدام مانع تسرب لوحة PCR يمكن التخلص منه. ثم ، دوامة لوحة لمدة 15 إلى 30 ثانية في أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 إلى 15 ثانية لجمع محتويات البئر في الجزء السفلي من اللوحة.

لإنشاء القطرات تلقائيا على شاشة اللمس الآلية لمولد القطرات، انقر فوق تكوين لوحة العينة وحدد الأعمدة التي توجد بها العينات على لوحة العينة. انقر فوق موافق وافتح باب مولد القطيرات الآلي. قم بتحميل لوحات توليد العينات والقطرات والمواد الأخرى اللازمة للتجربة في المواقع المعنية داخل الجهاز وأغلق الباب.

عندما تتحول شاشة اللمس إلى اللون الأخضر ، مما يشير إلى أن جميع المواد قد تم تحميلها في مواضعها الصحيحة ، حدد الزيت للمجسات وابدأ في توليد القطيرات. انتظر حتى يكتمل إنشاء القطرات وفقا للوقت المشار إليه على الشاشة. عندما تقول الشاشة أن القطرات جاهزة ، افتح الباب لإزالة اللوحة التي تحتوي على القطرات واستخدم سدادة اللوحة لمدة خمس ثوان عند 180 درجة مئوية لإغلاق اللوحة بختم رقائق قابل للثقب.

في غضون 30 دقيقة من توليد القطيرات ، ضع لوحة القطيرات المختومة في جهاز تدوير حراري عميق للبئر 96. اضبط حجم العينة على 40 ميكرولتر ودرجة حرارة الغطاء على 105 درجة مئوية. ثم ، PCR تضخيم القطرات.

لقراءة القطيرات ، بعد التضخيم ، انقل اللوحة الحرارية المدورة ذات 96 بئرا إلى قارئ قطرات وافتح البرنامج المصاحب على جهاز كمبيوتر متصل بقارئ القطيرات. من وضع الإعداد ، حدد جديد وانقر نقرا مزدوجا فوق أي بئر لفتح مربع حوار محرر البئر. حدد الآبار المراد قراءتها واضبط التجربة على القياس الكمي المطلق ، والمزج الفائق لإسقاط المزيج الرقمي PCR للمجسات.

استهدف نوعا واحدا إلى القناة 1 غير معروفة واستهدف نوعين إلى القناة 2 غير معروفة. قم بتعيين أسماء العينات بناء على تخطيط اللوحة وانقر فوق تطبيق وموافق. بعد حفظ القالب، انقر فوق تشغيل.

عندما يطلب منك البرنامج ، حدد لون FAM / HEX. في نهاية الحصول على البيانات ، قم بإزالة اللوحة من القارئ. قبل تحليل البيانات ، تحقق من البيانات من جميع الآبار للحصول على العدد الإجمالي للقطرات.

وقم بتعيين حد فاصل لقبول الحد الأدنى لعدد القطرات ليتم احتسابها كنتائج إيجابية أو سلبية. لتحليل الفحص البسيط والمزدوج ، انقر نقرا مزدوجا فوق ملف QLP ليتم تحليله وحدد تحليل. استخدم أدوات عتبة السعة 1D والسعة 2D للتمييز بين القطرات الموجبة والسالبة لكل بئر في القناة الصحيحة ، باستخدام التحكم في قالب العقدة وعينات التحكم الإيجابية كدليل.

بعد ذلك، قم بتصدير النتائج كملف CSV لإجراء تحليل إضافي. لفحص مزيج المسبار الثلاثي ، افتح ملف QLP وحدد الآبار المراد تحليلها في علامة تبويب محرر اللوحة. اضبط نوع التجربة على القياس الكمي المباشر والفحص على فحص المزيج الثلاثي ، وأدخل الاسم المستهدف.

ثم انقر فوق تطبيق. استخدم أدوات الرسم البياني لتعيين ألوان معينة لمجموعات مستهدفة مختلفة وفقا لتوجيهات اقتراحات نافذة الكتلة المنبثقة. عندما يتم تعيين جميع الألوان المستهدفة ، سيتم عرض بيانات القياس الكمي في نافذة بيانات البئر.

تصدير البيانات كملف CSV للتحليل النهائي. بالنسبة للمقايسة الرباعية ، اضبط نوع التجربة على القياس الكمي المباشر والفحص على مضاعف السعة. أدخل اسم الهدف وانقر فوق تطبيق.

استخدم أدوات الرسم البياني لتعيين ألوان معينة لمجموعات مستهدفة مختلفة وفقا لتوجيهات اقتراحات نافذة الكتلة المنبثقة. عندما يتم تعيين جميع الألوان المستهدفة ، سيتم عرض بيانات القياس الكمي في نافذة بيانات البئر. تصدير البيانات كملف CSV لإجراء تحليل إضافي.

كما لوحظ في تحليل تدرج درجة الحرارة التمثيلي هذا ، لم تستطع درجات حرارة الركوع المرتفعة التمييز بوضوح بين القطرات الموجبة والقطرات السالبة عند تشغيل اختبار مزدوج. ومع ذلك ، مع انخفاض درجة حرارة الركوع ، تم تحقيق الفصل الأمثل بين القطرات الإيجابية والسلبية. باستخدام نظام الكشف عن PCR الرقمي بقطرتين RT بلونين ، من الممكن اكتشاف هدف واحد واثنين وثلاثة وأربعة أهداف SARS-CoV-2 داخل عينة واحدة.

يمكن استخدام عينة تحكم بدون قالب لتحديد موقع القطرات السالبة للمساعدة في تعيين العتبة السالبة في المقايسات البسيطة. في المقايسات المزدوجة ، يمكن إجراء التحليل في قنوات فردية أو في سعة 2D. على الرغم من أن تحليل بيانات المقايسات المتعددة ذات الترتيب الأعلى ليس سهلا ، إلا أن هذه المقايسات مفيدة ، لأنها تسمح بتقييم ما يصل إلى ثماني مجموعات قطرات في مقايسات مزيج المسبار الثلاثي وما يصل إلى 16 مجموعة قطرات للمقايسات القائمة على السعة الرباعية.

اعتمادا على الفحص المراد تطويره ، تأكد من إضافة تركيزات التمهيدي والمسبار المستهدفة الصحيحة إلى المزيج الرئيسي. باستخدام هذا الإجراء ، يمكن للمرء تبديل الأهداف لتطوير مقايسات RT-ddPCR جديدة. يمكن استخدام هذه المقايسات لأغراض بحثية مختلفة أو لتشخيص الأمراض المعدية الناشئة.

منذ تطويرها ، تم استخدام هذه التقنية لتحديد دقيق لنسخ الحمض النووي الفيروسي في معايير مختلفة ، وجسم الإنسان ، والعينات البيئية.