تصور التنشئة العينية بواسطة المجهر الضوئي باستخدام rx3: GFP الزرد المعدل وراثيا
أبريل 5, 2021
هنا ، يتم توفير بروتوكول للتصوير بفاصل زمني لتشكل العين باستخدام مجهر لايت متاح تجاريا ومحطة عمل لمعالجة الصور لتحليل البيانات الناتجة. يفصل هذا البروتوكول إجراءات تخدير الجنين ، والتضمين في الأغاروز منخفض الانصهار ، والتعليق في غرفة التصوير ، وإعداد معلمات التصوير ، وأخيرا تحليل بيانات التصوير باستخدام برنامج تحليل الصور.
يوفر بروتوكولنا معلومات مرئية وفي الوقت الفعلي حول كيفية حدوث عملية تشكل العين في ظل كل من الظروف الطبيعية والمرضية. يسمح بروتوكولنا بالحصول السريع على z-stacks ، مما يقلل من مقدار الوقت بين كل صورة 3D في مجموعة البيانات. وهذا يوفر دقة زمنية متزايدة لكيفية حدوث تشكل العين.
يمكن أن يكون وضع الجنين داخل الشعيرات الدموية أمرا صعبا بسبب شكله الكروي في مرحلة السوميت المفردة ، لذلك من المهم تحميل أجنة متعددة في الشعيرات الدموية للتأكد من أن واحدا على الأقل في الاتجاه الصحيح. للتحقق من وجود سوميت في 10 ساعات بعد الإخصاب ، ضع الأجنة تحت مجهر ستيريو واستخدم محول التألق لتأكيد وجود الجين rx3: GFP. بمجرد تحديد ثلاثة إلى خمسة أجنة سوميت واحدة إيجابية GFP ، استخدم ملقط ناعم لتزيين الأجنة.
لتضمين الأجنة في الأغاروز ، انقل الأجنة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للأجنة E3 مع استكمال 168 ميكروغرام لكل ملليلتر من التريكاين وإضافة 500 ميكرولتر من الأغاروز المبرد ولكن السائل بنسبة 2٪ ودرجة حرارة الانصهار المنخفضة و E3 العازلة إلى الأنبوب مع خلط لطيف. استخدم شعيرات شعرية زجاجية بالملليمتر الواحد مع مكبس PTFE لسحب الأجنة المضمنة في الأغاروز إلى الشعيرات الدموية والسماح للأغاروز بالتصلب لمدة 30 إلى 60 ثانية في درجة حرارة الغرفة. ثم ضع الشعيرات الدموية في كوب من المخزن المؤقت E3 المكمل بالتريكين.
لإعداد مجهر خفيف لتصوير الأجنة، ضع الشعيرات الدموية في حامل العينة الشعرية وانقر فوق الغمد المعدني في وسط القرص المعدني للحامل. ضع سدادتين مطاطيتين في الغمد مع الشقوق التي تواجه نهايات الغمد وحرك الشعيرات الدموية عبر منتصف السدادات المطاطية. بمجرد أن تكون العلامة في قاعدة الغمد المعدني ، استخدم الغطاء المعدني لتثبيت الشعيرات الدموية في مكانها ووضع الحامل في الجزء العلوي من المجهر مع محاذاة العلامات البيضاء.
أغلق غطاء حامل العينة وانقر فوق الزر تحديد موقع الشعيرات الدموية في واجهة برنامج المجهر. باستخدام لوحة تحكم Ergo Drive ، حرك الشعيرات الدموية إلى أعلى الهدف مباشرة. بعد فتح الغطاء ، ادفع المكبس برفق حتى يتدلى قسم الأغاروز الذي يحتوي على الجنين أسفل القاع الشعري أمام الهدف.
قم بإيقاف تشغيل تحديد الموقع الشعري وانقر فوق تحديد موقع العينة لتبديل العرض من كاميرا ويب غرفة العينة إلى هدف المجهر واستخدم طريقة العرض هذه لضبط موضع العينة بشكل أكثر دقة. ثم قم بإيقاف تشغيل نموذج تحديد الموقع والتبديل إلى علامة التبويب الاستحواذ. حدد مربعات z-stack والسلاسل الزمنية.
في نافذة معلمات وضع الاستحواذ، حدد إعداد ورقة الإضاءة المزدوجة الجانب وحدد المربعات الخاصة بالاندماج المزدوج الجانب عبر الإنترنت والمسح الضوئي المحوري. انقر فوق مستمر للحصول على عرض حي للجنين. في نافذة القناة، حدد 488 قناة واضبط طاقة الليزر على قناة واحدة ووقت التعرض على 7.5 مللي ثانية.
استخدم لوحة تحكم Ergo Drive لضبط موضع الجنين حتى يواجه مجال العين الكاميرا مباشرة واضبط صفائح الإضاءة اليسرى واليمنى في معلمات القنوات حتى يكون مجال العين في بؤرة التركيز البؤري بشكل كاف. اضبط الوضعين الأول والأخير على شكل حرف z حوالي 500 ميكرومتر بعد آخر إشارة فلورسنت يمكن اكتشافها وانقر فوق الأمثل لضبط حجم الخطوة على 0.477 ميكرومتر. لتعيين معلمات الحضانة ، حدد المربع الخاص بوحدة Peltier للحفاظ على درجة الحرارة عند 28 درجة مئوية.
في نافذة السلسلة الزمنية، حدد التردد التجريبي المناسب والفاصل الزمني للحصول على الصور. انقر على بدء التجربة. حدد المجلد لحفظ مجموعة الصور وقم بتعيين بادئة الصورة، ثم انقر على حفظ لبدء التصوير.
لتحليل الصور ، قم باستيراد ملفات الصور إلى برنامج تحليل صور 4D مناسب وانقر فوق مكعب عارض 4D وشريط المقياس ورمز الفيديو لفتح شريط مهام لوحة العمل. حدد إضافة تسلسل إطار مفتاحي وحدد مدة الفيديو بالثواني. ألغ تحديد مربع إنشاء التدوير وحدد استخدام تقدم الوقت لتضمين نقاط زمنية محددة في الفيديو.
احفظ لوحة العمل لتطبيق نفس المعلمات على مجموعات صور متعددة. انقر فوق تصدير فيلم لحفظ فيديو لتصوير الفاصل الزمني وتحديد إعدادات تصدير الفيلم، بما في ذلك اسم الملف وموقعه وتنسيق الفيديو ودقة الفيديو ومعدل الإطارات ودقة البيانات. أضف الطوابع الزمنية إذا رغبت في ذلك وحدد السجل.
لإنشاء مقاطع فيديو للتدوير في نقاط زمنية محددة، أضف تسلسل إطار مفتاحي كما هو موضح للتو، ولكن حدد مربع إنشاء التدوير وقم بإلغاء تحديد مربع تقدم وقت الاستخدام. لعرض صورة عالية الدقة في أي اتجاه وفي أي نقطة زمنية فردية، حدد رمز الكاميرا في عارض 4D. لإنشاء خط أنابيب للتحليل، حدد قارورة للوصول إلى لوحة التحليل وافتح قائمة عمليات التحليل لتحديد تسلسل العمليات ذات الاهتمام.
انقر فوق المثلث الأزرق لبدء خط الأنابيب. في نهاية التشغيل، انقر على أعمدة المعالم في النافذة المنبثقة لعرض قائمة بالميزات التي يمكن أن توفر معلومات حول الكائن محل الاهتمام، ثم انقر على تصدير لتصدير البيانات إلى جدول بيانات. في هذا التحليل التمثيلي ، تم تصوير جنين rx3:GFP معدل وراثيا من وجهة النظر الظهرية كل خمس دقائق من مرحلة سوميت واحدة من خلال 24 ساعة بعد الإخصاب لمدة 14 ساعة.
وكما لوحظ، فإن إجراء تشغيل خط أنابيب للصور الملتقطة من هذا التحليل سهل توليد قناع للعين النامية. لاحظ أنه عندما يتم فصل مجال العين إلى حوصيفتين بصريتين ، يمكن ملاحظة منطقة إيجابية ثالثة rx3: GFP في الدماغ الأمامي ساهمت في منطقة ما تحت المهاد. وقد لوحظت هذه المعلومات أيضا في بيانات الحجم ويمكن فصلها بسهولة عن بيانات الحويصلة البصرية لأنها كانت أصغر بكثير في الحجم من تلك التي لوحظت لأي من الحويصلات البصرية.
يمكن متابعة هذا الإجراء بتحليلات إضافية ، على سبيل المثال ، تتبع الخلايا الفردية عبر مجموعة بيانات الصورة.
نظرة عامة
يحدد هذا البروتوكول طريقة لتصوير التطور المورفولوجيّ للعين باستخدام مجهر الضوء المقطعيّ. يشمل خطوات مفصلة لتحضير الجنين، إعداد التصوير، وتحليل البيانات.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء التنموي
- تقنيات التصوير
الخلفية
- التطور المورفولوجيّ للعين مهم لفهم تطور العين.
- تصوير الوقت المنقضي يوفر نظرة ثاقبة إلى العمليات البيولوجية الديناميكية.
- يسمح مجهر الضوء المقطعيّ بالتصوير عالي الدقة مع تقليل السمية الضوئية.
- توجيه الجنين أثناء التصوير هو عامل حاسم للنجاح.
هدف الدراسة
- تطوير بروتوكول موثوق لمراقبة التطور المورفولوجيّ للعين.
- تحسين الدقة الزمنية في تصوير العمليات التنموية.
- تسهيل تحليل كل من الحالات الطبيعية والمرضية.
الطرق المستخدمة
- تخدير الجنين وغرسه في الأغاروز.
- استخدام مجهر الضوء المقطعيّ للتصوير.
- اكتساب الصور وتحليلها باستخدام برامج متخصصة.
- إنشاء مقاطع فيديو للوقت المنقضي وخطوط بيانات التحليل.
النتائج الرئيسية
- تصوير ناجح لجنين rx3:GFP المعدّل وراثيًا على مدار 14 ساعة.
- تحديد المراحل التنموية الرئيسية والهياكل.
- إنشاء أقنعة لهياكل العين النامية.
- ملاحظة تشكل الحويصلة البصرية والهياكل الدماغية المرتبطة بها.
الاستنتاجات
- يوفر البروتوكول إطارًا قويًا لدراسة تطور العين.
- يمكن لتصوير الوقت المنقضي الكشف عن رؤى حاسمة في العمليات المورفولوجية.
- يمكن للدراسات المستقبلية البناء على هذه المنهجية لإجراء تحليلات إضافية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
High-resolution, time-lapse lightsheet microscopy of rx3:GFP transgenic zebrafish embryos enables direct visualization of vertebrate ocular morphogenesis in vivo. This workflow provides quantitative, 4D datasets that support mechanistic de-risking and target validation for early-stage ophthalmic discovery. The approach facilitates predictive confidence in evaluating genetic or pharmacological perturbations impacting eye development, informing risk-adjusted portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables real-time visualization of eye field specification and morphogenetic events.
- Supports functional validation of candidate genes or pathways involved in ocular development.
- Facilitates mechanistic de-risking by quantifying developmental phenotypes under experimental perturbations.
- Provides high-content imaging data for hypothesis-driven target triage.
Screening & Assay Development
- Establishes a reproducible, quantitative imaging platform for phenotypic screening of genetic or compound libraries.
- Delivers standardized, high-throughput compatible datasets for downstream analysis.
- Enables robust assay development with minimized photobleaching and phototoxicity.
- Supports reliable evaluation of compound effects on ocular morphogenesis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns zebrafish ocular development with vertebrate disease models for translational relevance.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of developmental targets.
- Provides quantitative endpoints for assessing disease-relevant phenotypes and biomarker alignment.
- Supports risk-adjusted advancement of ophthalmic candidates based on in vivo developmental outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging protocol integrates from early discovery through lead identification and preclinical validation in ophthalmic R&D pipelines.
- Discovery Biology: Quantitative 4D imaging supports hypothesis testing and pathway clarification in ocular development.
- Screening: Standardized imaging and analysis enable reproducible phenotypic screening and assay readiness.
- Analytics: Automated segmentation and feature extraction provide robust quantitative outputs for condition comparison.
- Translational Research: Disease-relevant zebrafish models bridge discovery and preclinical validation for ocular targets.
- Enterprise Reuse: The workflow is adaptable for diverse genetic, pharmacological, or environmental perturbation studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in ocular target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible imaging datasets for cross-team use.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient prioritization of ophthalmic programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement and de-risking of early-stage ocular assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish handling, transgenics, and advanced microscopy.
- Needs access to lightsheet microscopy and 4D image analysis infrastructure.
- Demands cross-team standardization of imaging and analysis parameters for reproducibility.
- Adaptable to other developmental models with appropriate genetic markers.
- Embryo orientation and imaging throughput may limit scalability for large screens.
