Name: الحث الموجه للعضويات الشبكية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: اكتشف بروتوكولاً محسّنًا لإنتاج العضويات الشبكية البشرية ثلاثية الأبعاد من الخلايا الجذعية متعددة القدرات. يُحسّن هذا الأسلوب كفاءة تمايز أسلاف الخلايا المستقبلة للضوء لنمذجة أمراض الشبكية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر أعضاء مختبر 502 على دعمهم الفني وتعليقاتهم المفيدة فيما يتعلق بالمخطوطة. تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية لبلدية بكين (Z200014) والبرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين (2017YFA0105300).

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات المؤسسية لمستشفى بكين تونغرين ، جامعة كابيتال الطبية. تم الحصول على H9 hESCs من معهد أبحاث WiCell وتمت هندستها وراثيا إلى خط الخلايا الموسوم بالطماطم.
1. توليد ROs البشرية
<ol><li>قم بزراعة hESCs في ظل ظروف خالية من التغذية.<ol><li>قم بتغطية بئر واحد من صفيحة من 6 آبار ب 1 مل من كاشف 0.1 مجم / مل A (جدول المواد) عند 37 درجة مئوية لمدة نصف ساعة على الأقل باتباع تعليمات الشركة المصنعة. إذابة أليكوت من 1x106 hESCs. ملاحظة: تحضير 3 مل من الكاشف B المسخن مسبقا (جدول المواد) ونقل الخلايا المحفوظة بالتجميد (1 مل) إلى 3 مل من الوسط الطازج. لا تقم بماصة hESCs إلى خلايا مفردة.</li>
		<li>جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق وإزالة السوبرناتانت.</li>
		<li>زرع الخلايا في لوحة الكاشف A المغلفة مع 2 مل من الكاشف B وتغيير 2 مل من الكاشف B يوميا. خلايا المرور عند الوصول إلى ما يقرب من 80٪ من الالتقاء (عادة حوالي 4 أيام).</li>
	</ol></li>
	<li>اليوم 0<ol><li>فصل hESCs إلى تعليق أحادي الخلية باستخدام الوسط I (الجدول 1). قم بإعداد الوسط I عن طريق خلط ما يلي: 20٪ (v / v) استبدال مصل KnockOut (KSR) ، محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM 0.1 mM (NEAA) ، 1 mM pyruvate ، 3 μM IWR-1-endo (IWR1e) ، 30 نانوغرام / مل COCO ، 100 U / mL البنسلين ، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين (PS) ، 0.1 mM β-mercaptoethanol ، والمتوسط الأساسي الأدنى في غلاسكو النسر (GMEM). ملاحظة: قبل بدء التفكك ، قم بإعداد الوسط I ونقل 12 مل من الوسط I مع 20 ميكرومتر Y-27632 إلى طبق بتري 10 سم ، و 500 ميكرولتر من الكاشف C (جدول المواد) يحتوي على 0.05 مجم / مل من الكاشف D (جدول المواد) و 20 ميكرومتر Y-27632 في أنبوب 1.5 مل. نفذ الخطوات المذكورة أعلاه في الظلام ، حيث أن المكون IWR1e في الوسط I حساس للضوء.</li>
		<li>اغسل hESCs باستخدام المخزن الملحي المخزن الملحي المخزن بالفوسفات (DPBS) من Dulbecco الذي تم تسخينه مسبقا 1x.</li>
		<li>أضف الكاشف المحضر 500 ميكرولتر (في أنبوب 1.5 مل) واحتضن hESCs لمدة 3.5 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.</li>
		<li>افصل الخلايا عن طريق تحريك جانب وأسفل اللوحة لبضع ثوان وأضف 500 ميكرولتر من الوسط المحضر I من طبق بتري إلى طبق hESC. ملاحظة: قم بإعداد أنبوب 1.5 مل مع 900 ميكرولتر من 1x DPBS واستخدم مقياس مرقئ الدم لعد الخلايا.</li>
		<li>حصاد الخلايا في أنبوب جديد 1.5 مل وماصة تعليق الخلية لأعلى ولأسفل ثم أخرج 100 ميكرولتر من الأنبوب ثم أضف إلى الأنبوب مع 900 ميكرولتر من DPBS لعد الخلايا.</li>
		<li>قم بتفريق تعليق الخلايا الأيسر 900 ميكرولتر ثم قم بتخفيف الخلايا ذات الوسط المحضر I في طبق بتري إلى 9 × 104 خلايا / مل. ملاحظة: الحجم الكامل للوسط هو 12 مل. هناك حاجة إلى 1.08 × 106 خلايا في المجموع.</li>
		<li>أضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلايا إلى كل بئر من صفيحة غير ملتصقة ، ذات قاع V ، 96 بئرا (جدول المواد). ملاحظة: استخدم ماصة متعددة القنوات لتقصير الوقت والتأكد من أن كل بئر يحتوي على رقم خلية مكافئ. رج طبق بتري في كل مرة قبل إزالة أجزاء 100 ميكرولتر. من المهم أن يتم توزيع الخلايا بشكل موحد.</li>
		<li>قم بتدوير اللوحة ذات ال 96 بئرا برفق في شاكر منخفض السرعة لمدة 5 دقائق ثم احتضنها عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. ملاحظة: احتفظ بالطبق في الظلام. تعيين اليوم كيوم 0.</li>
	</ol></li>
	<li>اليوم 2<ol><li>أضف 1٪ كاشف A (جدول المواد). تحضير الكاشف A (تركيز البروتين 10 ملغ / مل) عن طريق إضافة 133.4 ميكرولتر من الكاشف A إلى 2 مل من الوسط I. ملاحظة: حافظ على الكاشف A عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها قبل الاستخدام لتحقيق ذوبان كامل وموحد. يرجى ملاحظة معلومات المنتج والبحث في رقم الكتالوج ورقم اللوت في الموقع الرسمي للشركة للحصول على تركيز البروتين من الكاشف A حيث أن كل زجاجة من الكاشف A بتركيز بروتين مختلف. إذا كان تركيز البروتين منخفضا ، فسيكون من المفيد زيادة حجم الكاشف A.</li>
		<li>أضف 20 ميكرولتر من الكاشف المحضر A إلى كل بئر وماصة مرتين في الوسط لتشتيت الخلايا الميتة. ملاحظة: حافظ على الكاشف A ولوحة البئر 96 في ظل ظروف باردة وأكمل جميع الخطوات على الجليد. ضع اللوحة في الظلام.</li>
	</ol></li>
	<li>اليوم 2-12<ol><li>نظف الجزء السفلي من اللوحة المكونة من 96 بئرا واحتضنها عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 حتى اليوم 6. في اليوم 6 ، قم بتغيير نصف الوسط عن طريق إزالة 58 ميكرولتر من الوسط من كل بئر وإضافة 60 ميكرولتر من الوسط I. ملاحظة: استخدم ماصة متعددة القنوات لإكمال التغيير نصف المتوسط. قم بإجراء هذه الخطوة بلطف لضمان عدم إزالة كريات الخلايا من البئر. استخرج الوسط في طبق بتري نظيف بحجم 10 سم. إذا كانت هناك كريات خلوية في الداخل ، فأضفها مرة أخرى إلى لوحة 96 بئرا.</li>
	</ol></li>
	<li>اليوم 12-18<ol><li>تغيير المتوسط إلى المتوسط II (الجدول 1) في اليوم 12. تحضير المتوسط الثاني باستخدام كاشف 1٪ (v / v) A عن طريق خلط ما يلي: 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) ، 0.1 mM NEAA ، 1 mM pyruvate ، 100 U / mL البنسلين ، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين ، 0.1 mM β-mercaptoethanol ، 100 نانومتر SAG ثنائي هيدروكلوريد و GMEM. تخزينها في ظروف باردة ومظلمة.</li>
		<li>قم بحصاد كريات الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 15 مل من الصفيحة المكونة من 96 بئرا واسمح للكريات بالاستقرار بشكل طبيعي لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: قم بإزالة الوسط والكريات بلطف تحت السطح لتجنب الفقاعات.</li>
		<li>قم بإزالة السوبرناتانت أثناء العناية بالمواد العضوية. انقل مجاميع الخلايا إلى طبق معلق 10 سم يحتوي على 18 مل من الوسط المحضر II مع الكاشف A. ملاحظة: لا تقم بإضافة الوسط المحضر II إلى الطبق الذي يبلغ طوله 10 سم مقدما ، حيث يجب أن يكون الكاشف A عند 4 درجات مئوية.</li>
		<li>احتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 حتى اليوم 18.</li>
	</ol></li>
	<li>من اليوم 18 فصاعدا<ol><li>تغيير الوسط إلى المتوسط الثالث (الجدول 1). تحضير الوسط الثالث تحت الظروف المظلمة عن طريق خلط ما يلي: 10٪ FBS ، 1xsupplement 1 ، 0.5 μM حمض الريتينويك (RA) ، 100 ميكرومتر توراين ، 100 U / مل البنسلين ، 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين و 1: 1 خليط من وسط النسر المعدل من دولبيكو (DMEM) / خليط المغذيات F-12.</li>
		<li>في اليوم 18 ، عندما يتم إنشاء حويصلة بصرية شبه شفافة ، قم بقطع المواد العضوية باستخدام سكين الجراحة المجهرية. ملاحظة: شق العضوي، عادة إلى أربع قطع، في طبق بتري مع متوسط II. يجب أن تنمو كل قطعة لتصبح كوبا بصريا سليما في الأسابيع التالية.</li>
		<li>قم بتجميع جميع الكريات في وسط الطبق. حصاد الخلايا في أنبوب الصقر المخروطي 15 مل والسماح بالاستقرار الطبيعي. ثم قم بإزالة السوبرناتانت بلطف. ملاحظة: نظرا لأحجامها ، يمكن تجميع المواد العضوية في الوسط عن طريق تدوير طبق بتري في اتجاه واحد لمدة 90 درجة على مستوى أفقي عدة مرات.</li>
		<li>قم بتعليق الكريات وتفريقها في طبقين بتري بحجم 10 سم ، مع 18 مل من المتوسط الثالث لكل طبق ، وانقل الأطباق بلطف إلى الحاضنة لتجنب تراكم الخلايا. استمر في الزراعة في الوسط الثالث عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 وقم بتغيير الوسط أسبوعيا. تم التعبير عن CRX بعد اليوم 45 وحتى اليوم 120 ، يمكننا اكتشاف الجزء الخارجي من المستقبلات الضوئية.</li>
	</ol></li>
</ol>2. تحليل ROs البشرية
<ol><li>تحليل نظام مراقبة الأصول الأجنبية (FACS)<ol><li>قم بتجميع ثلاثة CRX-tdTomato وثلاثة عضويات مشتقة من H9 ES من الأطباق باستخدام نصائح 1 مل المقطوعة. اغسل المواد العضوية ب 1 مل من DPBS المسخن مسبقا (درجة حرارة الغرفة).</li>
		<li>تحضير المخزن المؤقت للهضم عن طريق خلط 0.25٪ من محلول التربسين-EDTA مع 0.05 ملغ / مل من الكاشف D.</li>
		<li>قم بفصل المواد العضوية إلى خلايا مفردة باستخدام مخزن الهضم المخزن المؤقت المحضر لمدة 8 دقائق عند 37 درجة مئوية. ثم أضف نفس الحجم من DPBS مع 10٪ FBS و 0.05 mg / mL من الكاشف D لتعطيل التفاعل.</li>
		<li>قم بتعليق الخلايا وتشتيتها برفق ثم قم بالتصفية باستخدام مصفاة خلية 100 ميكرومتر واستخدم نظام فرز الخلايا المنشط بالفلور (FACS) عند خط ليزر الإثارة 561 نانومتر ومرشح 780/60 لتحليل الإشارات الإيجابية CRX-tdTomato. ملاحظة: يعبر CRX في البداية في اليوم 45 ويزداد مع نضوج المواد العضوية. يتم استخدام عشرة آلاف خلية لكل اختبار ، لكل نقطة زمنية ، يتم إكمال ثلاثة تكرارات على الأقل.</li>
	</ol></li>
	<li>تحديد كمية كثافة التألق ل ROs<ol><li>إعداد المواد العضوية القابلة للحياة بشكل عشوائي للتصوير. ملاحظة: قم بتعيين المعلمات واستخدم نفس الفلاتر والمعلمات لجميع أجهزة مراقبة كثافة التألق.</li>
		<li>التقط الصور وقم بتحليل متوسط كثافة التألق باستخدام برنامج مناسب (على سبيل المثال ، ImageJ).</li>
		<li>استيراد الصور ثم تحويلها إلى 8 بت باستخدام صورة | النوع.</li>
		<li>اضبط العتبة باستخدام المعلمات الافتراضية بواسطة Image | ضبط | العتبة.</li>
		<li>تحديد المساحة المقاسة ثم تقييم القيمة الرمادية باستخدام تحليل | القياس. ملاحظة: القيم المتوسطة في لوحة النتائج هي متوسط كثافة التألق للمنطقة المقاسة.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Xie, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+accessibility+analysis+reveals+regulatory+dynamics+of+developing+human+retina+and+hiPSC-derived+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Chromatin accessibility analysis reveals regulatory dynamics of developing human retina and hiPSC-derived retinal organoids.</a> Science Advances. 6 (6), 5247(2020).</li>
<li>Lu, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Analysis+of+Human+Retina+Identifies+Evolutionarily+Conserved+and+Species-Specific+Mechanisms+Controlling+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Analysis of Human Retina Identifies Evolutionarily Conserved and Species-Specific Mechanisms Controlling Development.</a> Developmental Cell. 53 (4), 473-491 (2020).</li>
<li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Types+of+the+Human+Retina+and+Its+Organoids+at+Single-Cell+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell Types of the Human Retina and Its Organoids at Single-Cell Resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).</li>
<li>Jin, Z. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stemming+retinal+regeneration+with+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Stemming retinal regeneration with pluripotent stem cells.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 69, 38-56 (2019).</li>
<li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li>
<li>Pan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COCO+enhances+the+efficiency+of+photoreceptor+precursor+differentiation+in+early+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">COCO enhances the efficiency of photoreceptor precursor differentiation in early human embryonic stem cell-derived retinal organoids.</a> Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 366(2020).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+cone+photoreceptors+through+simultaneous+inhibition+of+BMP%2C+TGFbeta+and+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling.</a> Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).</li>
<li>Deng, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Correction+Reverses+Ciliopathy+and+Photoreceptor+Loss+in+iPSC-Derived+Retinal+Organoids+from+Retinitis+Pigmentosa+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Gene Correction Reverses Ciliopathy and Photoreceptor Loss in iPSC-Derived Retinal Organoids from Retinitis Pigmentosa Patients.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1267-1281 (2018).</li>
<li>Gao, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-Specific+Retinal+Organoids+Recapitulate+Disease+Features+of+Late-Onset+Retinitis+Pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Patient-Specific Retinal Organoids Recapitulate Disease Features of Late-Onset Retinitis Pigmentosa.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 128(2020).</li>
<li>Zhang, C. J., Ma, Y., Jin, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+road+to+restore+vision+with+photoreceptor+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The road to restore vision with photoreceptor regeneration.</a> Experimental Eye Research. 202, 108283(2020).</li>
<li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+confluent+human+iPS+cells+to+self-forming+neural+retina+and+retinal+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 111 (23), 8518-8523 (2014).</li>
<li>Kuwahara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+ciliary+margin-like+stem+cell+niche+from+self-organizing+human+retinal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue.</a> Nature Communications. 6, 6286(2015).</li>
</ol>

التمايز العضوي للشبكية هو طريقة مرغوب فيها لتوليد خلايا شبكية وظيفية وافرة. RO هو مركب من خلايا شبكية العين المختلفة ، مثل الخلايا العقدية ، والخلايا ثنائية القطب ، والمستقبلات الضوئية ، التي تولدها الخلايا الجذعية متعددة القدرات نحو شبكية العين العصبية4،5،8،9. على الرغم من أنه يمكن حصاد ROs المتقاربة ، إلا أنها تستغرق وقتا طويلا ، مما قد يتطلب فترات زراعة طويلة (تصل إلى 180 يوما). ومع ذلك ، با...

تتميز الخلايا الجذعية متعددة القدرات (PSCs) بتجديدها الذاتي وقدرتها على التمايز إلى جميع أنواع الخلايا الجسدية. وهكذا ، أصبحت المواد العضوية المشتقة من PSCs موردا مهما في أبحاث الطب التجديدي. يتميز تنكس الشبكية بفقدان المستقبلات الضوئية (القضبان والمخاريط) وظهارة صبغة الشبكية. يمكن أن يكون استبدال خلايا الشبكية علاجا مشجعا لهذا المرض. ومع ذلك ، ليس من الممكن الحصول على شبكية العين البشرية لأبحاث الأمراض وعلاجها. لذلك ، فإن عضويات الشبكية (ROs) المشتقة من PSCs ، والتي تلخص بشكل فعال وناجح خلايا الشبكية الأصلية متعددة الطبقات ، مفيدة للبحوث الأساسية والانتقالية1،2،3. يركز بحثنا على تمايز RO لتوفير خلايا كافية وعالية الجودة لدراسة تنكس الشبكية4.
طرق التمييز بين ROs آخذة في الظهور باستمرار ، مع تمايز التعليق ثلاثي الأبعاد (3D) الرائد من قبل مختبر ساساي في عام 20125. قدمنا علامة CRX-tdTomato في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) لتتبع خلايا سلائف المستقبلات الضوئية على وجه التحديد وعدلنا الطريقة بإضافة COCO ، وهو مضاد متعدد الوظائف لمسارات Wnt و TGF-β و BMP6. وقد ثبت أن COCO يحسن بكفاءة كفاءة كفاءة التمايز بين سلائف المستقبلات الضوئية والمخاريط 6,7.
إجمالا ، من خلال تعديل طريقة التمايز الكلاسيكية ، قمنا بتطوير بروتوكول يمكن الوصول إليه لحصاد سلائف المستقبلات الضوئية والمخاريط الوفيرة من ROs البشرية لتحليل مرض الشبكية المرتبط بالمستقبلات الضوئية من خلال التحقيقات المختبرية ولمزيد من التطبيق السريري / الزرع.

<table><tbody><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>COCO</td><td>R& D Systems</td><td>3047-CC-050</td><td>DAN عائلة مجال من مضادات BMP</td></tr><tr><td>DMEM / F-12</td><td>Gibco</td><td>10565-042</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>C141905005BT</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>مصل الأبقار الجنينية (FBS) ، مؤهل للصناعة البيولوجية للخلايا الجذعية الجنينية البشرية</td><td></td><td>04-002-1A</td><td></td></tr><tr><td>GMEM</td><td>Gibco</td><td>11710-035</td><td></td></tr><tr><td>استبدال مصل بالضربة القاضية - متعدد الأنواع</td><td>Gibco</td><td>A3181502</td><td></td></tr><tr><td>MEM محلول الأحماض الأمينية غير الأساسي (100X)</td> <td>sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Primesurface 96 V-plate</td><td>Sbio</td><td>MS9096SZ</td><td>تجميع الخلايا في 1.2.7</td></tr><tr><td>بيروفات</td><td>كاشف سيجما</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>A</td><td>BD</td><td>356231</td><td>Matrigel في 1.1.1</td></tr><tr><td>الكاشف B</td><td>StemCell</td><td>5990</td><td>mTeSR- E8 ، PSCs الوسط القاعدي في 1.1.2</td></tr><tr><td>الكاشف C</td><td>Gibco</td><td>12563-011</td><td>TrypLE Express في 1.2</td></tr><tr><td>الكاشف D</td><td>Roche</td><td>11284932001</td><td>DNase I ، في 1.2</td></tr><tr><td>حمض الريتينويك</td><td>Sigma</td><td>R2625-100MG</td><td></td></tr><tr><td>ملحق SAG</td><td>Enzo Life Science</td><td>ALX-270-426-M001</td><td></td></tr><tr><td>1</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>N-2 Supplement (100X) ، سائل ، مغطى في Medum III</td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td><td>T-8691-25G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25٪) ، تفكك الفينول الأحمر</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>العضيات في 2.1.3</td></tr><tr><td>Wnt Antagonist I ، IWR-1-endo - Calbiochem</td>مثبط <td>Sigma</td><td>681669</td><td>Wnt</td></tr><tr><td>Y-27632 2HCl</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td></td></tr></tbody></table>

الحث الموجه للعضويات الشبكية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات

Directed Induction of Retinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

زرع خلايا الشبكية هو نهج علاجي واعد ، والذي يمكن أن يعيد بنية الشبكية ويستقر أو حتى يحسن القدرات البصرية للشبكية المتدهورة. ومع ذلك، يواجه التقدم المحرز في العلاج ببدائل الخلايا حاليا تحديات تتطلب مصدرا جاهزا لشبكية العين البشرية عالية الجودة والموحدة. لذلك ، هناك حاجة إلى بروتوكول سهل ومستقر للتجارب. هنا ، نقوم بتطوير بروتوكول محسن ، يعتمد على طريقة التنظيم الذاتي باستخدام جزيئات خارجية المنشأ والكاشف A بالإضافة إلى الاستئصال اليدوي لتوليد عضويات شبكية العين البشرية ثلاثية الأبعاد (RO). يعبر RO المشتق من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (PSCs) عن علامات محددة للمستقبلات الضوئية. مع إضافة COCO ، وهو مضاد متعدد الوظائف ، تزداد كفاءة التمايز بين سلائف المستقبلات الضوئية والمخاريط بشكل كبير. الاستخدام الفعال لهذا النظام ، الذي له فوائد خطوط الخلايا والخلايا الأولية ، وبدون مشاكل المصادر المرتبطة بالأخير ، يمكن أن ينتج خلايا شبكية متقاربة ، وخاصة المستقبلات الضوئية. وبالتالي ، فإن التمايز بين PSCs و RO يوفر منصة مثالية وذات صلة بيولوجية لنمذجة الأمراض وفحص الأدوية وزرع الخلايا.

ويصور الرسم التوضيحي التخطيطي بروتوكول التمايز لتحسين خلايا السلائف باستخدام كوكو (الشكل 1). من PSC إلى ROs ، يمكن أن تتسبب العديد من التفاصيل في اختلافات في النتائج. يوصى بتسجيل كل خطوة وحتى رقم الكتالوج ورقم اللوت لكل وسيط لتتبع الإجراء بأكمله.
هنا ، نقدم صورا ميدانية مشرقة للأيام 6 و 12 و 18 و 45 (الشكل 2). في اليوم 6 ، يبلغ قطر المواد العضوية عادة حوالي 600 ميكرومتر في صفيحة من 96 بئرا ، مع وصلات كثيفة في الداخل وحافة مشرقة (<stro...

باستخدام طريقة التنظيم الذاتي ، نقوم بتطوير بروتوكول مع إضافة COCO يمكن أن يزيد بشكل كبير من توليد المستقبلات الضوئية.

Retinal cell transplantation is a promising therapeutic approach, which could restore the retinal architecture and stabilize or even improve the visual ...

هذا هو نموذج لأمراض الشبكية ويحاكي شبكية العين في الجسم الحي. إلى حد ما ، يمكن أن تحل محل التجارب على الحيوانات. تم تحسين البروتوكول لنوعية وكمية سلائف المستقبلات الضوئية في عضويات الشبكية ، والمستقبل الضوئي هو المفتاح للعديد من حالات العمى التي لا رجعة فيها.ابدأ بزراعة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية ، أو hESCs ، في ظل ظروف خالية من التغذية. للقيام بذلك ، قم بتغطية بئر واحد من صفيحة من ستة آبار بملليلتر واحد من 100 ميكروغرام لكل ملليلتر من الكاشف A ، واحتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة نصف ساعة على الأقل. قم بإذابة أليكوت من مليون hESCs ، وقم بطرده مركزيا عند 200 xg لمدة خمس دقائق.بعد إزالة السوبرناتانت ، قم بزرع الخلايا في الصفيحة المطلية سابقا ، إلى جانب ملليلترين من الكاشف B.Passage الخلايا بعد الوصول إلى ما يقرب من 80٪ من الالتقاء في حوالي أربعة أيام. بعد الوصول إلى الالتقاء ، اغسل الخلايا باستخدام DPBS المسخن مسبقا ، وانقلها إلى 500 ميكرولتر من الكاشف الطازج. ثم ، احتضن الخلايا لمدة 3.5 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.افصل الخلايا عن طريق تحريك جانب وأسفل اللوحة لبضع ثوان ، وأضف 500 ميكرولتر من الميكرولتر المتوسط المحضر. حصاد الخلايا المنفصلة في أنبوب جديد 1.5 ملليلتر ، وماصة تعليق الخلية لأعلى ولأسفل. لحساب الخلايا ، أضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلايا إلى 900 ميكرولتر من DPBS.قم بتخفيف 900 ميكرولتر من تعليق الخلية المتبقي مع واحد متوسط في طبق بتري لتحقيق تسع مرات 10 إلى خلايا الطاقة الرابعة لكل ملليلتر. أضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلايا المخفف إلى كل بئر من صفيحة غير ملتصقة ، ذات قاع V ، 96 بئرا. قم بتدوير اللوحة برفق على شاكر منخفض السرعة لمدة خمس دقائق ، واحتضنها عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون حتى اليوم الثاني.في اليوم الثاني ، أضف 20 ميكرولتر من الكاشف A بنسبة 1٪ إلى كل بئر من صفيحة البئر 96 ، وماصة مرتين في الوسط لتشتيت الخلايا الميتة. نظف الجزء السفلي من اللوحة قبل احتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون حتى اليوم السادس. في اليوم السادس ، استبدل 58 ميكرولتر من الوسط ب 60 ميكرولتر من الوسط الطازج ، واستمر في الحضانة.في اليوم 12 ، قم بحصاد كريات الخلايا من صفيحة 96 بئرا في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر ، واسمح للكريات بالاستقرار بشكل طبيعي لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. عندما تستقر الكريات ، قم بإزالة supernatant دون إزعاج المواد العضوية ، ونقل مجاميع الخلايا إلى طبق معلق 10 سم يحتوي على 18 ملليلتر من الوسط الثاني مع كاشف A.احتضان الطبق عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى اليوم 18. في اليوم 18 ، تأكد من توليد حويصلة بصرية شبه شفافة في الطبق ، وقطع المواد العضوية المتولدة باستخدام سكين الجراحة المجهرية.قم بتجميع جميع الكريات المقطوعة في وسط الطبق. ثم ، قم بحصاد الخلايا في أنبوب فالكون مخروطي 15 ملليلتر. عندما تستقر الخلايا ، قم بإزالة السوبرناتانت بلطف ، وأعد تعليق الكريات في طبقين بتري بطول 10 سنتيمترات مع 18 ملليلتر من الوسط ، ثلاثة لكل طبق.انقل الأطباق بلطف إلى الحاضنة لتجنب تراكم الخلايا. استمر في زراعة الخلايا ، وتغيير الوسط أسبوعيا. تحليل تعبير CRX بعد اليوم 45 حتى اليوم 120.في هذا التحليل التمثيلي ، يتم عرض مراحل مختلفة من توليد الشبكية البشرية. في اليوم السادس ، ظهرت المواد العضوية كمجموعة من الاتصالات الكثيفة داخل حافة مشرقة يبلغ قطرها حوالي 600 ميكرومتر. في اليوم 12 ، حدث الجيل الأولي من الهياكل الشبيهة بالحويصلة البصرية.تم التخلص من المواد العضوية التي لا تحتوي على بنية مناسبة تشبه الحويصلة قبل الزراعة في طبق بتري في اليوم 18. بحلول اليوم 30 من الثقافة ، كانت الهندسة المعمارية الشبيهة بالحويصلة أكثر وضوحا ، ويمكن تمييز ROs الأدنى وإزالتها بسهولة. بدءا من اليوم 45 ، عبرت المواد العضوية عن علامات مختلفة لسلائف المستقبلات الضوئية ، مثل CRX و RCVRN و OTX2.من خلال شق المواد العضوية الشبكية المتفوقة ، يتم تحسين كفاءة التمايز بشكل كبير ، ويمكن حصاد أكثر من 100 مادة عضوية متفوقة من 96 لوحة.

directed-induction-retinal-organoids-from-human-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Medicine

الطب

يمكن استخدام  خلايا ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) المشتقة من الخلايا الجذعية لتطبيقات متعددة بما في ذلك العلاجات القائمة على الخلايا لتنكس الشبكية ونمذجة الأمراض ودراسات الأدوية. نقدم هنا بروتوكولا بسيطا لاشتقاق RPE بشكل متكرر من الخلايا الجذعية.

اشتقاق كفاءة خلايا الظهارة الصبغية الشبكية من الخلايا الجذعية

ويصف هذا البروتوكول كيفية إنتاج الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية (RPE) من الخلايا الجذعية pluripotent. يستخدم الأسلوب مزيج من عوامل النمو والجزيئات الصغيرة لتوجيه تمايز الخلايا الجذعية إلى RPE غير ناضجة في أربعة عشر يوما و RPE ناضجة، والوظيفية بعد ثلاثة أشهر.

التفريق بين الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية من الخلايا الجذعية Pluripotent المستحث أو الجنينية البشرية سريعة وموجهة

إنتاج خلايا الشبكية المتخصصة من الخلايا الجذعية pluripotent نقطة تحول في تطوير العلاج القائم على الخلايا الجذعية لأمراض الشبكية. تصف هذه الورقة طريقة بسيطة لجيل بكفاءة أورجانويدس الشبكية وظهاره المصطبغة الشبكية للبحوث الأساسية ومتعدية الجنسيات، والسريرية.

خالية كرة محددة وشروط الثقافة خالية من علبة التغذية بالورق "نماذج الخلية الشبكية" المستمدة من اللجنة التوجيهية جيل من البشر

هنا نحن نصف نظام التعريفي الجهازي الشبكية الأمثل، والتي هي مناسبة لمختلف خطوط الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات لتوليد أنسجة الشبكية مع استنساخ عالية والكفاءة.

نظام تحريض الشبكية Organoid لاستخلاص أنسجة الشبكية ثلاثية الأبعاد من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات

يصف هذا البروتوكول طريقة فعالة للتمييز بين hiPSCs إلى مجموعات مجال العين وتوليد عضويات عصبية شبكية باستخدام ظروف ثقافة مبسطة تتضمن أنظمة ثقافة ملتصقة ومعلقة. يمكن أيضا عزل أنواع خلايا العين الأخرى ، مثل RPE وظهارة القرنية ، من حقول العين الناضجة في مزارع الشبكية.

توليد عضويات الشبكية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان وأمراض الشبكية الصحية والخاصة بأمراض الشبكية

يصف البروتوكول الحالي نظام تحريض شبكية العين العصبي 3D الأمثل الذي يقلل من التصاق وانصهار عضويات الشبكية مع قابلية عالية للتكرار والكفاءة.

توليد شبكية العين العصبية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات

يقدم هذا البروتوكول طريقة لتوليد العضيات الوعائية باستخدام الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات.

توليد العضوية الوعائية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان

يجمع هذا البروتوكول بين المقاصة البصرية ووضع العلامات المناعية للتصوير متحد البؤر بالحجم الكامل لحضيات الشبكية المثبتة بالكامل. إنه يحافظ على الهيكل ثلاثي الأبعاد ، مما يتيح التصور التفصيلي للمسارات العصبية الرئيسية ، ويحسن دراسة نضوج الشبكية ، والتنظيم المكاني ، وتطبيقاته المحتملة في نمذجة الأمراض والطب الشخصي.

تصور عضوي الشبكية بالكامل مع الدقة الخلوية

وصف طريقة العزلة وتوصيف الخلايا الجذعية البشرية الأسنان اللب (hDPSCs) باستخدام...

العزلة، وتوصيف المقارن التمييز بين الخلايا الجذعية البشرية الأسنان اللب المستمدة من الأسنان الدائمة باستخدام طريقتين مختلفتين

عزل الخلايا الجذعية السرطانية (الخلايا الجذعية السرطانية) مباشرة من الأنسجة البشرية اللازمة لتوصيف البيولوجية. يصف هذا المخطوط منهجية لعزل الخلايا الجذعية السرطانية في البروستاتا من الأنسجة البشرية، مع توفير النصائح حول استكشاف الأخطاء وإصلاحها الخطوات الصعبة.

عزل الخلايا الجذعية للسرطان من العينات البشرية سرطان البروستاتا

اكتشف بروتوكولاً محسّنًا لإنتاج العضويات الشبكية البشرية ثلاثية الأبعاد من الخلايا الجذعية متعددة القدرات. يُحسّن هذا الأسلوب كفاءة تمايز أسلاف الخلايا المستقبلة للضوء لنمذجة أمراض الشبكية.

الحث الموجه للعضويات الشبكية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات

استكشف المزيد من الفيديوهات