حيود الإلكترون الجهورالوفولفي للجزيئات الصغيرة
مارس 15, 2021
هنا ، نصف الإجراءات التي تم تطويرها في مختبرنا لإعداد مساحيق بلورات الجزيئات الصغيرة لتجارب حيود الإلكترون البلوري الدقيق (MicroED).
في هذا الإجراء ، نوضح كيفية الانتقال من مسحوق جزيء صغير إلى بنية ثلاثية الأبعاد في دقائق. هذه تقنية تحويلية لمجتمع الكيمياء. العديد من المركبات لا تنمو بسهولة إلى بلورات كبيرة.
باستخدام MicroED ، يمكننا تحديد هياكل الدقة الذرية من بلورات بحجم النانومتر. سيوضح الإجراء الدكتور مايك مارتينوفيتش وهو أستاذ في جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس. للبدء ، انقل كمية صغيرة من المسحوق أو السائل أو المواد الصلبة إلى قنينة أو أنبوب صغير.
بالنسبة للعينات الموجودة بالفعل في شكل مسحوق ، أغلق الأنبوب باستخدام الغطاء حتى تكون هناك حاجة إلى العينة. وبالمثل ، جفف العينات السائلة إلى مساحيق. لف الفيلم البلاستيكي حول أحد طرفي شريحة الغطاء الزجاجي.
ضع شبكات TEM على الفيلم أعلى شريحة الغطاء مع توجيه جانب الكربون باللون البني لأعلى. بعد ذلك ، ضع الشريحة مع شبكات في غرفة تفريغ التوهج وقم بتفريغ شريحة الغطاء المتوهجة لمدة 30 ثانية تقريبا باستخدام الإعداد السلبي عند 15 بيكوأمبير. قم بتخزين الشبكات على شريحة الغطاء داخل طبق بتري زجاجي مبطن بورق ترشيح قبل إضافة العينة إلى الشبكات.
قم بإزالة شبكة TEM ذات التفريغ المتوهج من طبق بتري المغطى باستخدام ملاقط وضعها على ورق ترشيح دائري بحيث يكون جانب الكربون متجها لأعلى. باستخدام ملعقة صغيرة ، قم بإزالة مغرفة صغيرة جدا من المسحوق وضعها على غطاء زجاجي مربع صغير بجوار شبكة TEM على ورق الترشيح. ضع شريحة زجاجية مربعة صغيرة أخرى أو غطاء فوق المسحوق.
بالأصابع ، افرك الشريحتين الزجاجيتين معا برفق لعمل مسحوق ناعم. قم بزاوية انزلاق الغطاء وضعه فوق شبكة TEM مباشرة على ورق الترشيح واستمر في فرك انزلاقات الغطاء معا على بعد بضعة سنتيمترات فقط فوق شبكة TEM التي تم تفريغها من التوهج. لاحظ ما إذا كان المسحوق يسقط باتجاه الشبكة.
اكشف المسحوق المطحون ناعما عن طريق إزالة إحدى زلات الغطاء الزجاجي. ثم قم بتنظيف المسحوق الناعم برفق من الغطاء على شبكة TEM باستخدام قطعة من ورق الترشيح. أمسك بحافة شبكة TEM باستخدام مجموعة محددة من الملقط ، مع التأكد من أن الأطراف لا تثقب أيا من مربعات الشبكة.
ارفع الشبكة من سنتيمتر إلى سنتيمترين فوق ورق الترشيح وقم بزاوية الشبكة بزاوية 90 درجة إلى الورق أدناه. اضغط برفق على الملقط مع الحفاظ على الشبكة منتفخة بإحكام لإزالة أي مسحوق سائب. قم بتجميد الشبكة عن طريق تحريك طرف الملقط مع الشبكة مباشرة في حاوية النيتروجين السائل باليد وانتظر حتى تتوقف الشبكة والملاقط عن الغليان.
تحت النيتروجين السائل ، ضع الشبكة في حامل العينة مع توجيه جانب الكربون بحيث تصطدم العينة بالشعاع قبل فيلم دعم الكربون. قم بتحميل حامل العينة في TEM للتأكد من أن الشبكة يتم الاحتفاظ بها دائما في درجات حرارة النيتروجين السائل. بالنسبة لأنظمة اللودر التلقائي ، ضع الشبكات المقطوعة في كاسيت في حاوية مبردة بالنيتروجين السائل ، مما يسمح لروبوتات اللودر التلقائي بقبول الكاسيت مع الحفاظ على العينات آمنة للتنقل بين اللودر التلقائي والعمود.
افتح صمامات العمود TEM واضبط التكبير باستخدام لوحات اليد إلى أدنى تكبير ممكن. ابحث عن الشعاع عن طريق ضبط مقبض الشدة على الألواح اليدوية بحيث تكون المنطقة الساطعة المستديرة مرئية على شاشة الفلورسنت. خذ أطلس الشبكة بالكامل بتكبير منخفض باستخدام برنامج مناسب يضمن محاذاة المجهر جيدا لكل من تصوير التكبير المنخفض والعالي قبل جمع بيانات MicroED عالية الدقة.
حدد مربعات الشبكة بدون الكربون المكسور والحبيبات السوداء أو الداكنة المرئية على الفيلم. تنقل حول الشبكة إما فعليا باستخدام عصا التحكم الموجودة على الألواح اليدوية أو فعليا على الأطلس الذي تم جمعه للبحث عن مربعات الشبكة غير المكسورة والتي تحتوي على بلورات دقيقة. أضف مركز كل من هذه المربعات إلى قائمة مواقع الشبكة للتحقيق ، والتي يمكن إضافتها إلى دفتر ملاحظات في واجهة مستخدم المجهر أو في برنامج أتمتة المجهر.
اضبط التكبير بين 500 إلى 1300x. اضبط الارتفاع المركزي في كل موقع شبكة مخزن وقم بتحديث قيمة z المحفوظة إلى المواضع المذكورة. ابحث إما على شاشة الفلورسنت أو على كاميرا مسطحة عن البقع السوداء الصغيرة أو الحبوب على الشبكة.
غالبا ما يكون للعينة الجيدة حواف حادة عند التكبير العالي مما يشير إلى وجود بلورة بالترتيب. انقل بلورة محتملة موجودة إلى وسط الشاشة وقم بزيادة التكبير بحيث يدخل TEM في وضع التكبير العالي. أدخل فتحة منطقة محددة وقم بتغيير فتحة العدسة إلى حجم أكبر أو أصغر للتأكد من أن المساحة المحددة أكبر من البلورة.
قم بالتبديل إلى وضع الانكسار عن طريق الضغط على زر الانكسار على لوحات يد TEM للتأكد من إدخال شاشة الفلورسنت. اضبط طول الكاميرا باستخدام مقبض التكبير بحيث تكون الحافة بدقة أنجستروم واحدة على الأقل. اضبط تركيز الحيود بحيث تكون البقعة المركزية حادة وصغيرة قدر الإمكان.
باستخدام مقابض إزاحة الحيود ، انقل الشعاع المركزي إلى مركز شاشة الفلورسنت. أدخل توقف الشعاع للتأكد من أن الشعاع خلفه. ارفع شاشة الفلورسنت والتقط تعريضا ضوئيا قصيرا للكاميرا.
افحص نمط الانكسار المقابل ، وتأكد من أن النموذج سيحتوي على بقع حادة يتم ترتيبها بانتظام في أعمدة وصفوف. احفظ الإحداثيات البلورية إما في واجهة مستخدم TEM أو عن طريق كتابتها ، ثم كرر فحص الحيود لجميع البلورات المحتملة ذات الأهمية في مربع الشبكة الحالي. قم بتوسيط البلورة التي تم فحصها بتكبير أكبر من 1000x واضبط الارتفاع المركزي للبلورة باستخدام روتين تلقائي أو يدويا.
أدخل فتحة المنطقة المحددة التي تناسب حجم الكريستال وشكله على أفضل وجه. قم بإمالة المرحلة في الاتجاهين السلبي والموجب حتى يتم حجب الصورة بواسطة أشرطة الشبكة. ولاحظ هذه الزوايا لأغراض جمع البيانات من خلال قراءة البيانات كل ثانية واحدة على كاميرا حديثة مع وضع قراءة الغالق المتداول.
اضبط معدل الدوران عن طريق تحديد النسبة المئوية لسرعة الإمالة القصوى ومتى تتوقف في واجهة مستخدم المجهر أو البرنامج المخصص. حفظ البيانات في مجموعة متنوعة من التنسيقات يقول إما إطارات فردية أو ككومة من الصور. يظهر فيلم الانكسار في شكل بلوري تم جمعه من بلورات دقيقة مجموعة بيانات MicroED ذات دوران مستمر من بلورة صغيرة كاربامازيبين محددة على شبكة TEM.
بعد جمع البيانات والتكامل وحل الهيكل ، يتم تحديد بنية عالية الدقة ويعتمد وضوحها على جودة البيانات واكتمالها. يعد تطبيق العينة على الشبكة أمرا بالغ الأهمية للحصول على بيانات جيدة. باتباع هذه الطريقة ، يمكن معالجة البيانات بشكل أكبر باستخدام برنامج البلورات القياسي.
إن إثبات أن MicroED هي طريقة قوية للجزيئات الصغيرة قد فتح استخدامها في جميع أنحاء العالم لحل هياكل جديدة من الجزيئات ذات الأهمية الحاسمة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تصف هذه المقالة إجراءً لتحضير مساحيق الجزيئات الصغيرة لتجارب حيود إلكترون البلورات الدقيقة (MicroED). تسمح هذه التقنية بتحديد هياكل بدقة ذرية من البلورات ذات الحجم النانوي، وهي تقدم مهم للمجال الكيميائي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- حيود إلكترون البلورات الدقيقة
- علم الأحياء البنيوي
- بلورات الجزيئات الصغيرة
الخلفية
- العديد من المركبات لا تنمو بسهولة في بلورات كبيرة.
- يوفر MicroED حلاً لتحديد هياكل من البلورات الصغيرة.
- يمكن لهذه الطريقة إنتاج نتائج في غضون دقائق.
- يقوم الدكتور مايك مارتينويويتز من جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس بتوضيح الإجراء.
هدف الدراسة
- لعرض تقنية ثورية لبلورات الجزيئات الصغيرة.
- لتمكين الباحثين من تحديد الهياكل ثلاثية الأبعاد بسرعة.
- لتسهيل دراسة المركبات التي يصعب بللورتها.
الطرق المستخدمة
- تحضير مساحيق الجزيئات الصغيرة.
- نقل المساحيق إلى قوارير أو أنابيب صغيرة.
- استخدام MicroED لتحديد الهيكل.
- التوضيح بواسطة باحث ذو خبرة.
النتائج الرئيسية
- تحديد ناجح لهياكل بدقة ذرية.
- معالجة سريعة من المساحيق إلى هيكل ثلاثي الأبعاد.
- تطبيق MicroED على مجموعة متنوعة من الجزيئات الصغيرة.
- فهم محسّن للمركبات التي يصعب بللورتها.
الاستنتاجات
- MicroED هي تقنية قيّمة لعلم الأحياء البنيوي.
- تفتح هذه الطريقة طرقاً جديدة للبحث في الكيمياء.
- تحدّ بشكل كبير من الوقت المطلوب لتحديد الهيكل.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Microcrystal electron diffraction (MicroED) enables rapid, atomic-resolution structure determination of small molecules directly from nanocrystals, addressing a key bottleneck in pharmaceutical discovery. This capability enhances predictive confidence in early-stage compound characterization and accelerates the transition from chemical synthesis to structural validation. MicroED's compatibility with standard cryo-EM infrastructure positions it as a scalable, enterprise-ready solution for portfolio-wide structural elucidation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct atomic-level structure determination of drug candidates from minimal sample quantities.
- Reduces reliance on large crystal growth, de-risking early-stage compound progression.
- Supports rapid hypothesis testing for molecular identity and conformation.
- Facilitates functional target validation by confirming compound structure prior to downstream assays.
Screening & Assay Development
- Prepares validated microcrystal grids for high-throughput structural screening workflows.
- Delivers reproducible, quantitative diffraction data for compound assessment.
- Enables scalable screening of diverse chemical libraries using standardized protocols.
- Supports reliable evaluation of compound purity and polymorphism.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural data with translational biomarker development when structure-activity relationships are critical.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by providing definitive molecular structures.
- De-risks advancement decisions by confirming compound integrity before in vivo studies.
- Supports mechanistic studies requiring precise molecular geometry.
Pipeline & Workflow Integration
MicroED integrates into the discovery continuum from early compound synthesis through lead identification and preclinical validation, providing a structural checkpoint that informs go/no-go decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by confirming molecular structure at the nanocrystal stage.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible microcrystal grids for downstream structural and functional analyses.
- Analytics: Generates quantitative diffraction patterns and high-resolution structural outputs for comparative assessment.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by ensuring structural fidelity of candidate molecules.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable protocol applicable across diverse compound classes and R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in compound characterization.
- Operational Value: Delivers rapid, standardized, and reproducible workflows compatible with existing cryo-EM infrastructure.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions and enhances capital efficiency by minimizing delays in structural validation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of structurally confirmed candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-EM sample handling and TEM operation.
- Depends on access to glow discharge chambers, liquid nitrogen, and high-resolution TEM instrumentation.
- Demands cross-team standardization of grid preparation and data collection protocols.
- Adaptable to a wide range of small molecules, peptides, and pharmaceutical compounds.
- Sample quality and grid preparation are critical for obtaining high-quality diffraction data.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:34
Preparing Small Molecule Samples and TEM Grids
1:37
Applying Sample to Grids by Creating a Homogenous Fine Powder
2:51
Freezing and Loading Grids into the TEM
4:12
Locating and Screening Nanocrystals
7:33
Collecting MicroED Data
8:36
Results: Analysis of MicroED Dataset from Carbamazepine Microcrystal
9:10
Conclusion
