تقييم المخاطر الكيميائية الزراعية لملكات نحل العسل المتزاوج

تم تطوير هذا البروتوكول لتعزيز فهم كيفية تأثير المواد الكيميائية الزراعية على نحل العسل(Apis mellifera)الاستنساخ من خلال إنشاء طرق لتعريف ملكات نحل العسل والقائمين على رعايتهم العاملين بالمواد الكيميائية الزراعية في بيئة مختبرية خاضعة للرقابة ومراقبة استجاباتهم ذات الصلة بعناية.

يمكن أن يكون للتعرض للكيماويات الزراعية تأثيرات كبيرة على جميع أعضاء مستعمرة نحل العسل ، بما في ذلك أهم عضو ، الملكات. ولكن حتى وقت قريب، كانت هناك أدوات قليلة متاحة لدراسة هذه الآثار. تسمح هذه التقنية للباحثين بتعريض الملكات لكيماويات زراعية في ظل ظروف خاضعة للرقابة تحاكي الظروف التي قد يتعرضون لها في هذا المجال.

من السهل جدا إزعاج سلوكيات وضع بيض ملكة نحل العسل ، لذلك من المهم توخي الحذر عند التعامل مع العمال والملكات قبل وأثناء التجربة. إثبات هذه الإجراءات سيكون، ايمي فلويد وإليزا ليتسي، فنيي المختبرات في وحدة البحوث الصحية الأنواع الغازية والملقحات، مختبر أبحاث نحل العسل. للبدء، وتجميع أقفاص مراقبة الملكة، أو QMCs، عن طريق إدراج لوحات الباب، ثم إدراج استبعاد الملكة في باب غرفة التغذية فوق غرفة التغذية، للحفاظ على الملكة من دخول والاتصال النظام الغذائي المعالجة.

إدراج ELP واحد. لا تضيف أنابيب التغذية إلا بعد إضافة العمال إلى القفص ، وتغطية ثقوب التغذية الأربعة مؤقتا بشريط الصف المختبري. بعد جمع واحتضان إطارات مشط الشمع التي تحتوي على حضن العامل المغطى من مستعمرات نحل العسل ، قم بتنظيف النحل المغلق في حاوية مفتوحة مبطنة بطلاء حاجز حشري ، لمنع النحل من الزحف.

أضف ما لا يقل عن 50 النحل حسب الوزن إلى غرفة وضع البيض في كل QMC. لضمان إدخال مجموعة وراثية متنوعة ، والحصول على عدد مماثل من النحل العامل من ثلاث مستعمرات على الأقل ، والسماح لهم بالخلط قبل إضافة النحل إلى QMCs. إضافة مغذيات تحتوي على محلول السكروز والماء ومكملات حبوب اللقاح.

استخدام الملكات المشتراة من مربي تجاري في غضون 48 ساعة من الاستلام. بينما الملكة لا تزال داخل قفص الشحن، وضعه في كيس بلاستيكي واضح. ثم ضع أحد طرفي أنبوب بلاستيكي متصل بعلبة غاز ثاني أكسيد الكربون داخل الكيس ، وفتح صمام العبوة برفق للسماح لغاز ثاني أكسيد الكربون بالتدفق.

عندما يتم نفخ الحقيبة بالغاز، أغلق صمام العبوة في وقت واحد واغلق الحقيبة لاعتراض الغاز في الداخل. أبقي الحقيبة مغلقة لمدة 30 ثانية أو حتى تتوقف الملكة عن الحركة إزالة الملكة عن طريق فتح قفص الشحن مرة واحدة ويلاحظ أن الملكة فاقد الوعي.

افتح الباب جزئيا لغرفة وضع البيض، وضع الملكة فاقد الوعي بلطف داخل وإغلاق الغطاء. إضافة ELP الثاني إلى كل QMC. ضع شريطا مختبريا في الجزء العلوي من جهازي ELPs لمنعهما من الانفصال عن إطار QMC ، ومنع العمال من الخروج من القفص.

وضع الأقفاص في حاضنة مظلمة مع ظروف بيئية مستقرة من 34 إلى 35 درجة مئوية، والرطوبة النسبية 50-70٪. لإدارة النظام الغذائي الذي تغلب عليه المواد الكيميائية الزراعية، وإعداد حلول المخزون من المواد الكيميائية الزراعية في المذيبات المناسبة، مثل الأسيتون، بتركيز التي يمكن إضافتها إلى النظام الغذائي لتحقيق التركيز النهائي المطلوب من الكيماويات الزراعية ذات الفائدة. إدارة العلاجات الكيميائية الزراعية في محلول السكروز، ملحق حبوب اللقاح التجارية، أو كليهما.

إعداد النظام الغذائي التجريبي للاستخدام في نفس اليوم، عن طريق إضافة كمية مناسبة من محلول المخزون إلى درجة حرارة المبردة أو الغرفة، محلول السكروز 50٪. تخلط جيدا عن طريق الدوامة بسرعة متوسطة. لمكملات حبوب اللقاح, إضافة كمية محسوبة من محلول مخزون المواد الكيميائية الزراعية إلى محلول السكروز, ودوامة جيدا قبل إضافته إلى مسحوق الملحق.

أضف النظام الغذائي إلى أنابيب التغذية وسجل الأوزان المغذية قبل وضعها في QMC. لتحديد وضع البيض، ابدأ بإزالة QMCs من الحاضنة. فحص ظهور ELPs واضحة، إذا كان البيض موجودة، وإزالة لوحة الباب أمام لوحة من الفائدة.

قم بإزالة الشريط من جميع أنحاء ELPs، وحرك لوحة الباب بين ELP والنواس داخل QMC. مع لوحة الباب في مكان، وإزالة ELP والعد وتسجيل عدد من البيض داخل خلايا ELP. إزالة البيض عن طريق النقر على حافة ELP فتح الخلية الجانب إلى أسفل، على سطح صلب.

بمجرد سقوط البيض، استبدل ELP الفارغ في QMC. قم بإزالة لوحة الباب واستبدالها بلطف خلف ELP على السطح الخارجي ل QMC. كرر حسب الضرورة مع ELP الثاني واستبدال الشريط عبر QMC عند الانتهاء.

لمراقبة استهلاك الطعام، استبدل الطعام بنظام غذائي طازج كل يومين. إعداد أنابيب التغذية الجديدة ووزنها قبل البدء في أنشطة مراقبة إنتاج البيض. مبادلة الأنابيب القديمة مع جديدة، وتزن الأنابيب القديمة قبل التخلص منها.

قارن الوزن النهائي للأنبوب المغذي والنظام الغذائي غير المستهلك بوزن نفس الأنبوب ، لتقدير استهلاك النظام الغذائي. تحقق مرة واحدة في اليوم للتأكد من أن مغذيات فارغة أبدا. إذا كان أنبوب التغذية فارغا أو شبه فارغ، قم بإزالتها، وإعادة تعبئتها، وتسجيل وزن الأنبوب قبل وبعد، وإضافة الفرق إلى إجمالي استهلاك النظام الغذائي لمدة يومين ل QMC.

عند نقطة محددة أثناء تجربة QMC، قم بإزالة ELPs التي تحتوي على بيض طازج من QMC كما هو موضح سابقا، ولكن لا تطرد البيض من ELP. قم بتغطية ELP أولا بختم لوحة PCR ، ثم غطاء ميكروبليت عالمي ، ووضعه داخل مزيل الجفاف بمحلول كبريتات البوتاسيوم المشبع. تقييم معدلات الفقس بعد حوالي 78 ساعة من إزالة ELPs من QMC.

تشير يرقة على شكل حرف C في الجزء السفلي من الخلية إلى حدث فقس ناجح. إذا كانت مراكز إدارة الجودة قد تم ملؤها بعمال زائدين ، فاختبر النحل العامل في نقطة زمنية محددة أثناء التجربة لتقييم التغيرات الناجمة عن العلاج في فسيولوجيا. قبل أخذ العينات، ضع لوحة باب بين ELP والداخلية من QMC، وإزالة ELP.

بعناية، ارفع لوحة الباب على بعد 0.5 سنتيمتر تقريبا من قاعدة القفص، وأزل نحلة عامل من داخل مركز قطر الطبي باستخدام ملاقط وزن الريشة. لتحليل التعبير الجيني، المفاجئة تجميد النحل في النيتروجين السائل وتخزينها في 80 درجة مئوية. الحفاظ على النحلة التي تم جمعها لمتابعة التحليل، وتكرار هذه العملية حتى يتم جمع العدد المطلوب من العينات.

تم تقييم التغيرات المتعلقة بالعلاج الغذائي imidacloprid في عدد البيض اليومي من خلال تنفيذ معادلة تقدير معمم خطي سجل بواسون ، مع مصفوفة ارتباط تنازلي تلقائي. وكان الإنتاج اليومي للبيض أقل بكثير في QMCs نظرا لمكملات حبوب اللقاح والسكروز التي تحتوي على 50 جزءا في المليار إيميداكلوبريد. ولوحظ تأثير يعتمد على الجرعة على العدد الإجمالي للبيض المنتج في كل QMC لعلاجات إيميداكلوبريد التي تدار في كل من السكروز ومكملات حبوب اللقاح.

مع أكبر انخفاض لوحظ في QMCs تغذية 50 أجزاء في المليار إيميداكلوبريد، تليها 10 أجزاء في المليار في ملحق حبوب اللقاح بالإضافة إلى السكروز. ولم يلاحظ أي فرق في مجموع البيض المنتج بين المكافحة، وكانت مراكز إدارة الجودة تطعم 10 أجزاء في المليار من إيميداكلوبريد ومكمل حبوب اللقاح وحدها. وسجلت مكملات حبوب اللقاح، والمياه واستهلاك السكروز كل 48 ساعة لمدة 10 أو 12 يوما.

زادت المعدلات اليومية لاستهلاك السكروز بشكل كبير مع تقدم التجربة، ولكن معدلات استهلاك مكملات حبوب اللقاح انخفضت. ولوحظ ارتفاع معدلات استهلاك حبوب اللقاح عندما تم إعطاء 10 أجزاء في المليار إيميداكلوبريد في ملحق حبوب اللقاح وحدها. وانخفض المعدل عندما تم إعطاء 10 أو 50 جزءا في المليار في ملحق حبوب اللقاح وحل السكروز معا.

استخدام النحل القديم اليوم أمر بالغ الأهمية لضمان قبول الملكة والحد من العامل على إعادة تنشيط. أيضا حاسمة، هو التعامل مع دقيق للملكة والحفاظ على الأقفاص في بيئة مستقرة.