مراقبة تفاعلات البروتين والرباط في الخلايا البشرية عن طريق الرنين المغناطيسي النووي الكمي داخل الخلية في الوقت الفعلي باستخدام مفاعل حيوي عالي الكثافة للخلايا

يوفر التحليل الطيفي للرنين المغناطيسي النووي داخل الخلية نهجا فريدا لدراسة بنية البروتين ووظيفته مباشرة في الخلايا الحية ومراقبة العمليات ذات الصلة بيولوجيا مثل تفاعلات البروتين والليغاند. يمكن لهذا المفاعل الحيوي NMR الحفاظ على عدد كبير من الخلايا البشرية قابلة للحياة ونشطة استقلابيا لعدة أيام في مقياس الطيف ، وتمكين تطبيقات الرنين المغناطيسي النووي في الخلية في الوقت الحقيقي. يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي بروتين داخل الخلايا قابل للذوبان وقابل للسقوط بحرية يخضع لتغيرات تكوينية أو كيميائية.

ويزيد وضع العلامات على النظائر من إمكانية تطبيق هذه الطريقة. للبدء ، قم بتجميع وحدة التدفق باستخدام أنبوب NMR لوحدة التدفق الثانية ، والذي سيتم استبداله لاحقا بأنبوب يحتوي على خلايا. ارجع إلى تعليمات تشغيل وحدة التدفق للحصول على التجميع الصحيح.

اضبط الحمام المائي المتصل بوحدة التحكم في درجة حرارة وحدة التدفق على 37 درجة مئوية وضع زجاجة الخزان في الحمام المائي. قم بتوصيل أنبوب FEP الخاص بزجاجة الخزان بالمضخة. أدر صمام المفاعل الحيوي لتجاوز المضخة واملأها مسبقا بمتوسط.

ثم ، قم بتحويل صمام المفاعل الحيوي إلى التدفق وملء المفاعل الحيوي مسبقا بالوسط بمعدل 0.1 ملليلتر في الدقيقة. خذ قارورة T75 من خلايا HEK 293 T المنقولة من حاضنة ثاني أكسيد الكربون وقم بإزالة الوسط المستهلك. أضف ملليلترين من التربسين EDTA إلى الخلايا واحتضنها لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لفصل الخلايا.

قم بتعطيل التربسين باستخدام 20 ملليلتر من DMEM الكامل وأعد تعليق الخلايا تماما عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. ثم قم بنقلها في أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر. الطرد المركزي للخلايا في 800X G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة والتخلص من supernatant.

انقل حبيبة الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق مغطى بسعة 1.5 ملليلتر. لتضمين الخلايا في خيوط الأغاروز ، قم بإذابة أليكوت واحد من الأغاروز الصلب عند 85 درجة مئوية في سخان كتلة ، ثم احتفظ به في محلول عند 37 درجة مئوية في سخان الكتلة. باستخدام ماصة باستور ، املأ الجزء السفلي من أنبوب NMR لوحدة التدفق ب 60 إلى 70 ميكرولتر من هلام الأغاروز بنسبة 1.5٪ وضعه على الجليد لإنشاء قابس سفلي بارتفاع خمسة ملليمترات.

سخني حبيبة الخلية لمدة 15 إلى 20 ثانية في سخان الكتلة وأعد تعليق الخلايا بعناية في 450 ميكرولتر من محلول الأغاروز ، مع تجنب تكوين فقاعات. قم بشفط تعليق الخلية / الأغاروز في أنبوب كروماتوغرافي PEEK بطول 30 سم يبلغ قطره الداخلي 0.75 ملم متصل بحقنة بملليلتر واحد. اترك الأنبوب يبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين.

املأ مسبقا أنبوب NMR لوحدة التدفق ب 100 ميكرولتر من PBS في درجة حرارة الغرفة. صب خيوط الخلايا المضمنة في الأغاروز في وحدة التدفق أنبوب الرنين المغناطيسي النووي عن طريق دفع المحقنة بلطف. قم بإزالة أنبوب الرنين المغناطيسي النووي الفارغ من وحدة التدفق وزيادة معدل التدفق إلى ملليلتر في الدقيقة لبضع دقائق لإزالة فقاعات الغاز المتبقية في أنابيب المدخل.

اضبط معدل التدفق على 0.2 ملليلتر في الدقيقة وأدخل أنبوب الرنين المغناطيسي النووي الذي يحتوي على الخلايا عن طريق دفعه لأعلى ببطء ولكن بثبات. قم بتزويد وسط المفاعل الحيوي بمعدل تدفق 0.1 ملليلتر في الدقيقة. اضبط درجة الحرارة في مطياف الرنين المغناطيسي النووي على 310 كلفن وأدخل وحدة التدفق في مطياف.

بمجرد إدخال المفاعل الحيوي في مطياف الرنين المغناطيسي النووي ، انتظر بضع دقائق للسماح بالتبادل المتوسط. اضبط مطابقة قناة البروتون وضبطها ، وقم بتحريك المغناطيس ، واحسب طول نبضة البروتون الصلبة 90 درجة. اضبط مستويات طاقة البروتون في كل تسلسل نبضة وفقا لنبضة البروتون الصلبة.

تسجيل أول طيف الرنين المغناطيسي النووي للبروتون zgesgp لتسجيل محتوى العينة في تجانس المجال. انسخ zgesgp و p3919gp أو تجارب SOFAST-HMQC إلى الرقم المطلوب ووضعها في قائمة الانتظار في التخزين المؤقت للاستحواذ. حقن محلول مركز من الجزيء الخارجي في زجاجة الخزان المتوسطة عن طريق ثقب أنبوب السيليكون بحقنة معقمة طويلة الإبرة.

في نهاية تجربة الرنين المغناطيسي النووي ، استبدل الأنبوب الذي يحتوي على الخلايا بأنبوب فارغ وشطف وحدة التدفق بالماء. بالنسبة للخلايا التي تعبر عن الأنهيدراز الكربوني غير المسمى ، قم بمعالجة أطياف p3919gp عن طريق تطبيق وظيفة نافذة الملء الصفري وتوسيع الخط الأسي. بالنسبة للخلايا التي تعبر عن النيتروجين-15 المسمى ، ديسموتاز الفائق الأكسيد ، قم بمعالجة أطياف SOFAST-HMQC من خلال تطبيق وظيفة نافذة جرس الصفر والعلامة المربعة في كلا البعدين.

في MATLAB، قم باستيراد المناطق الطيفية باستخدام البرنامج النصي المخصص Load_ascii_spectra. قم بتشغيل البرنامج النصي Load_acqus لاستخراج الطوابع الزمنية من أطياف 1D. افتح MCR-ALS 2.0 GUI عن طريق تشغيل البرنامج النصي mcr_main، وفي علامة التبويب تحديد البيانات، قم بتحميل مصفوفة الأطياف.

تحقق من البيانات عن طريق رسمها. تقييم عدد المكونات، إما عن طريق تحلل القيمة المفردة أو يدويا، وحدد طريقة للتقدير الأولي للأطياف النقية. يمكن استخدام أنقى كشف متغير أو تحليل عامل متطور.

في النافذة تحديد مجموعة البيانات، حدد متابعة. قم بتعيين قيود التركيزات في نافذة وضع القيود:الصف. تطبيق قيد غير سلبي ، واختيار fnnls كتنفيذ ، واثنين كعدد من الأنواع.

بعد ذلك ، قم بتطبيق قيد إغلاق واحد ، واضبط القيد على واحد ، وشرط قيد الإغلاق على أنه يساوي ، وينطبق على جميع الأنواع. قم بتعيين القيود الخاصة بالأطياف في نافذة القيود:وضع العمود. تطبيق قيد غير سلبي ، واختيار fnnls كتنفيذ ، واثنين كعدد من الأنواع.

في النافذة النهائية ، قم بتعيين 50 تكرارا ومعيار تقارب 0.01. حدد أسماء المخرجات للتركيزات والأطياف والانحراف المعياري. انقر فوق متابعة لتشغيل تركيب MCR-ALS.

يمكن الحفاظ على الخلايا الموجودة في المفاعل الحيوي على قيد الحياة لمدة تصل إلى 72 ساعة ، كما هو مؤكد من خلال اختبار التربان الأزرق. تم استخدام المفاعل الحيوي للرصد في الوقت الحقيقي لربط اثنين من المثبطات ، الأسيتازولاميد والميثازولاميد بالأنهيدراز الكربوني المفرط في التعبير عنه في سيتوسول خلايا HEK 293 T. تم تقييم وجود إشارات من البروتين المفرط في التعبير وتجانس المجال باستخدام أول طيف بروتون نحت الإثارة.

وفي حالة الأنهيدراز الكربوني، تم رصد الارتباط داخل الخلايا للمثبطين عن طريق رصد إشارات البروتون في المنطقة الواقعة بين 11 و 16 جزءا في المليون من طيف WATERGATE، الناشئ عن الهيستيدين المنسق للزنك والمخلفات العطرية الأخرى. تم تأكيد الربط الناجح من خلال ظهور إشارات إضافية. تم استخدام MCR-ALS لفصل إشارات الرنين المغناطيسي النووي الناشئة عن الأنهيدراز الكربوني الحر والمقيد ، وتوفير ملامح التركيز النسبية للنوعين.

تم تطبيق المفاعل الحيوي لمراقبة تكوين رابطة ثنائي كبريتيد ثنائي الكبريتيد داخل الجزيئات الفائقة المرتبطة بالزنك التي يعززها الإبسلين ، وهو تقليد بيروكسيديز الجلوتاثيون. فصل تحليل MCR-ALS في مناطق مختارة من الطيف 2D الإشارات الناشئة عن النوعين وقدم ملامح تركيزها النسبي. من المهم إدخال وإزالة أنبوب الرنين المغناطيسي النووي لوحدة التدفق ببطء وثبات لتجنب قفزات الضغط التي قد تسبب تكوين فقاعات.

وقد مهد تطوير المفاعلات الحيوية للرنين المغناطيسي النووي الطريق لدراسة العمليات المعتمدة على وقت الاستبانة الذرية، مثل تخطيط تنظيم إعادة التشغيل والتفاعلات الدوائية/المستهدفة في الخلايا الحية.