إعداد و Cryo-FIB micromachining من Saccharomyces cerevisiae للتصوير المقطعي كريو إلكترون
نوفمبر 20, 2021
نقدم بروتوكولا لإعداد اللاميلا للعينات البيولوجية المجمدة من خلال التصوير الدقيق لشعاع الأيونات الذي يركز على التبريد للدراسات الهيكلية عالية الدقة للجزيئات الكبيرة في الموقع مع التصوير المقطعي للإلكترونات المبردة. يوفر البروتوكول المقدم مبادئ توجيهية لإعداد lamellae عالية الجودة مع استنساخ عالية لتوصيف الهيكلية للجزيئات الكلية داخل Cerevisiae Saccharomyces.
هذا الفيديو سوف تركز على إعداد السالمونيلا الخميرة للتصوير المقطعي الكريو الإلكترون سوف نذهب من خلال سير العمل من زراعة الخلايا إلى التصوير المقطعي بالتبريد الإلكترون Saccharomyces cerevisiae تزرع لإعداد عينة أيون في تعليق فمن المستحسن للعمل في ظروف معقمة داخل مربع تدفق صفح يتم إضافة عشرة ملليلتر من الخميرة المعقمة المستخرجة إلى المتوسطة لزراعة الخلايا لتعقيم قارورة زراعة ملليلتر واحد من الجلوكوز 20 في المئة معقمة إلى القارورة مع زراعة متوسطة مستعمرة خميرة واحدة يتم انتقاؤها بعناية من لوحة الزراعة لدينا ونقلها إلى وسيط النمو المعدة في قارورة زراعة قارورة زراعة قارورة زراعة ثم يتم تغطيتها مع احباط ومختلطة جيدا لتفريق الخلايا يتم وضع ثقافة الخلية في الحاضنة وتزرع في ثلاثين درجة مع التحريض المستمر حتى يتم التوصل إلى المرحلة الأسية نمت ثقافة خلايا الخميرة تصل إلى مرحلة الأسي ويتم قياس الكثافة المادية الخلية من قبل عقد متر ضد وسيط نظيفة كما يتركز نموذج المرجعية ثقافة الخلية إلى OD1 أو OD30 بالإضافة إلى خمسة في المئة من الجلسرين قبل بلانش تجميد الكهربائية المجهرية الشبكات السطح يتم تنظيف وتفعيلها لتطبيق تعليق الخلية من قبل شبكات البلازما توضع في غرفة تفريغ توهج تواجه الجانب الكربوني حتى ويتم تعيين إجراء تنظيف البلازما إلى ثلاثين إلى خمسة وأربعين ثانية شبكات EM لديها الآن وأنها مستعدة للخلية عينة تطبيق Vitrification تعليق خلايا الخميرة على شبكات EM يتم عن طريق تجميد بلانش في الإيثان السائل باستخدام آلة Vitrobot إعداد الإيثان السائل يحدث عن طريق تسييل غاز الإيثان في كوب معدني تبريده مع شبكة النيتروجين السائل EM مع تعليق الخلية هو ملطخة بورق تصفية من الجانب الخلفي والبلاستيك غير لاصقة عازمة من درجة حرارة الجانب الكربون الأمامي داخل غرفة Vitrobot يتم تعيين إلى يتم تعيين ثمانية عشر درجة والرطوبة إلى مائة في المئة وقت الانتظار، والوقت لطخة وقوة لطخة على شاشة Vitrobot وكذلك يتم اختيار شبكة تفريغ توهج من قبل ملاقط فيتروبوت وشنت على الصك ثلاث نقاط خمسة microliters من Saccharomyces cerevisiae تعليق يتم تطبيقها على الجانب الكربوني من الشبكة داخل تعليق غرفة المناخ Vitrobot يحتاج إلى أن تكون مختلطة بشكل صحيح قبل كل تطبيق لشبكة الشبكة هو بلانش المجمدة المجمدة في شبكات المجهر الكهربائي الإيثان السائل مع خلايا متهاوى يتم تخزينها في ظل ظروف النيتروجين السائل أو شنت في خرطوشة الشبكة للتحميل في شبكة المجهر CRYO SEM مع الخلايا المهزوتة ثم يتم تأمين في خرطوشة الشبكة مناسبة للتحميل على كل من SEM وTEM المجاهر C-مقطع حلقة شنت على أداة لقطة وتبريدها في شبكة النيتروجين السائل يتم وضعها على شبكة خرطوشة الشبكة الكربون التي تواجه أسفل وقص مع ثم يتم وضع عينة حلقة C-كليب في مربع الشبكة الخاصة عينة لإعداد lamila يتم تحميلها إلى شعاع مزدوج FIB / SEM المجهر وتناسب مع وعاء تحميل غرفة إعداد مرحلة التبريد يتم تبريده بشكل صحيح ومليء حامل عينة النيتروجين السائل يسمى يتم وضع المكوك في وتبريدها وكذلك مربع الشبكة مع عينة يتم نقلها من dewar التخزين إلى وعاء ويتم وضع الشبكات في فتحات اثنين في المكوك الكربون الجانب مع الخلايا التي تواجه في حالة استخدام خراطيش الشبكة FIB قطع من خرطوشة الشبكة ينبغي أن تكون محاذاة بعناية إلى الساعة الثانية عشرة في شبكات المكوك يتم تشديد من المسمار ويتم قلب المكوك وصولا الى تحميل موقف تحميل وعاء يوضع في محطة نقل وتغطي مع غرفة نقل الغطاء مع وعاء التحميل يتم وضعها على الجزء العلوي من الغطاء وضخها من خلال وعاء التحميل يتم تثبيت المكوك فراغ منخفضة مع شبكات على قضيب ومغلقة داخل غرف غرفة نقل صغيرة التي تم جمعها إلى غرفة إعداد ويتم إدراج المكوك على مرحلة التبريد في مرحلة غرفة SEM فراغ عالية يميل إلى 45 درجة وانتقلت أربعة ملليمترات على موقف مركز الشبكة إدراج إبرة نظام حقن الغاز يخلق طبقة واقية من العضوية على العينة البيولوجية ضد الضرر الإشعاعي خلال مركزة ثم يتم البصق شبكات الطحن شعاع أيون المغلفة مع حجاب رقيقة من المعدن غير العضوي لإنشاء طبقة موصلة على المواد البيولوجية تركز طحن شعاع الأيونات من lamella في كتلة الخلية أو يتم نقل monolayer في مرحلة خطوات قليلة إلى منطقة زاوية الطحن من الفائدة ويتم إنشاء أنماط الطحن العلوي والسفلي يتم طحن lamella الخام مع انخفاض تدريجي من FIB الحالي وسماكة lamella يتم تلميع النهائي من lamella يؤديها فقط مع نمط العلوي والمنخفضة FIB الحالي لتجنب الضرر الأمامي وتأثير الستائر على lamella شعاع الإلكترون السطحي يظهر التقدم المحرز خلال عملية الطحن هنا يمكننا أن نرى lamella مصقول النهائي سمك النهائي من lamella يحتاج إلى أن يكون أقل من مائتين وخمسين نانومتر لتكون شفافة لنقل شعاع الإلكترون التوضيح من lamella طحن في كتلة الخلية ومونولابير مع إيجابيات وسلبيات يتم نقل كل من أنواع الشبكات عينة مع lamali بلطف جدا من خلال غرفة إعداد العودة إلى وعاء وعاء التحميل يتم تبريدها ومليئة النيتروجين السائل الطازجة والنظيفة لتجنب التلوث الجليدي من شبكات lamali المطحون تتم إزالتها من المكوك وإعادتها إلى عينة مربع الشبكة مع lamali المطحون يتم نقل أخيرا إلى شبكة المجهر الكريب الإلكترون الإرسال يجب أن تكون تسعين درجة استدارة قبل الإدراج في كاسيت TEM autoloader لضمان التوجه السليم لللاميلا فيما يتعلق الوصول إمالة TEM يتم فحص Lamili والمنطقة ذات الأهمية للحصول على البيانات الطبوغرافية الإلكترون المبرد هو محور Lamella الرئيسي هو عمودي على محور الميل من المجهر لرؤية الحقل الأيمن للعرض في زوايا الميل العالي يتم استخدام طريقة قياس الدوسيمتر لجمع بيانات التصوير المقطعي الإلكتروني التبريد التي تم جمعها توموغرام ثم في برنامج إيتومو ومكونوليتر مجزأة في أميرا البرمجيات في هذا البروتوكول أظهرنا لك كيفية إعداد بكفاءة عينة خلية الخميرة لآلة صغيرة lamella باستخدام cryo تركز الطحن شعاع الأيونات وكيفية إعداد ومعالجة البيانات التصوير المقطعي الإلكتروني وlamli الخلية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولاً مفصلاً لتحضير عينات خميرة Saccharomyces cerevisiae من أجل التصوير المقطعي الإلكتروني المبرد (cryo-ET) باستخدام تقنية صقل الحزمة الأيونية المركزة المبردة (cryo-FIBM). يغطي سير العمل جميع الخطوات، بدءاً من زراعة الخميرة والتزجيج وصولاً إلى تحضير الصفائح واكتساب البيانات، مما يتيح إجراء دراسات بنيوية عالية الدقة للمكونات الداخلية للخلايا.
مكونات الدراسة الأساسية
مجال العلم
- البيولوجيا البنيوية
- البيولوجيا الخلوية والجزيئية
- المجهر الإلكتروني المبرد
خلفية علمية
- يوفر التصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد (Cryo-ET) بيانات هيكلية بدقة تقترب من المستوى الذري للمجمعات الجزيئية الكبيرة في موقعها الطبيعي.
- يقتصر التصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد عالي الدقة على العينات الرقيقة (<200 nm)، مما يقيد الدراسات بمحيط الخلايا.
- يتيح استخدام التصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد والمطحون بالحزمة الأيونية المركزة (Cryo-FIBM) تحضير رقائق خلوية رقيقة من عينات أكثر سمكاً، مما يسمح بالوصول إلى المناطق الداخلية للخلية.
- تُعد خميرة Saccharomyces cerevisiae كائناً نموذجياً حقيق النواة واسع الاستخدام في الأبحاث البيولوجية.
الغرض من الدراسة
- توفير بروتوكول خطوة بخطوة لتحضير صفائح الخميرة المناسبة للتصوير المقطعي الإلكتروني المبرد (cryo-ET).
- توضيح عملية التزجيج وتحضير الصفائح لكل من رقع الخلايا المعزولة والطبقات أحادية الخلية على شبكات المجهر الإلكتروني النافذ (TEM).
- تسهيل الدراسات البنيوية عالية الدقة للخلايا حقيقية النواة بما يتجاوز المناطق الطرفية.
الطرق المستخدمة
- زراعة الخميرة في ظروف معقمة وصولاً إلى الطور الأسي.
- تحضير شبكات المجهر الإلكتروني (EM grids) وتنظيفها بالبلازما.
- التزجيج لـمعلقات الخميرة على الشبكات عن طريق التجميد الغمري في الإيثان الجهاز باستخدام Vitrobot.
- تركيب الشبكات المزججة في خراطيش ونقلها إلى مجهر FIB/SEM مزدوج الحزمة مزود بمنصة تبريد (cryo-stage).
- تغطية العينات بطبقات واقية عضوية وغير عضوية.
- الطعن باستخدام حزمة أيونية مركزة لإنتاج شرائح رقيقة (<250 nm) من التكتلات الخلوية أو الطبقات أحادية الخلية.
- نقل الشرائح المطعونة إلى مجهر TEM مبرد (cryo-TEM) للحصول على بيانات التصوير المقطعي.
- معالجة البيانات باستخدام برنامجي Etomo و Amira.
النتائج الرئيسية
- التحضير الفعال لصفائح الخميرة المناسبة لتحليل التصوير المقطعي الإلكتروني المبرد (cryo-ET).
- بروتوكولات لكل من تجمعات الخلايا وعينات الطبقة الواحدة، مع مناقشة المزايا والعيوب الخاصة بكل منهما.
- إنتاج صفائح رقيقة بما يكفي لنفاذ الحزمة الإلكترونية والتصوير عالي الدقة.
- الاستحواذ والمعالجة الناجحة لبيانات cryo-ET من الصفائح المُحضرة.
الاستنتاجات
- يسمح البروتوكول الموصوف بتحضير عينات الخميرة بشكل موثوق للدراسات البنيوية في الموقع باستخدام التصوير المقطعي الإلكتروني المبرد (cryo-ET).
- تعمل تقنية التصوير المقطعي الإلكتروني المبرد المعتمدة على الحزمة الأيونية المركزة (Cryo-FIBM) على توسيع نطاق تطبيق cryo-ET ليشمل الأجزاء الداخلية للخلايا حقيقية النواة.
- يدعم سير العمل هذا الاستقصاءات الخلوية والجزيئية المتقدمة في البيولوجيا البنيوية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
تتيح تقنية التشغيل الآلي المجهري بالحزمة الأيونية المركزة المبردة (cryo-FIB) إجراء التصوير المقطعي الإلكتروني المبرد (cryo-ET) عالي الدقة للأجزاء الداخلية من الخلايا حقيقية النواة، متجاوزةً بذلك القيود التقليدية المتعلقة بالسُمك. يدعم سير العمل هذا فرق البيولوجيا التركيبية التي تسعى إلى تحقيق ثقة تنبؤية في تحديد مواقع المجمعات الجزيئية الضخمة وتنظيمها داخل البيئات الخلوية السليمة. وتجعل قابلية هذا البروتوكول للتكرار والتوسع منه قدرة أساسية لمراحل الاكتشاف المبكر ومسارات الأبحاث الانتقالية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير للصناعات الدوائية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يتيح التصوير المباشر للمعقدات الجزيئية الكبيرة في سياق خلوي طبيعي لتقليل المخاطر الآلية.
- يدعم التحقق الوظيفي من الأهداف من خلال الكشف عن العلاقات المكانية والتوطن تحت الخلوي.
- يسهل الاستقصاء القائم على الفرضيات لبنية الخلايا حقيقية النواة ذات الصلة بنماذج الأمراض.
الفحص وتطوير المقايسة
- يوفر تحضيراً معيارياً لصفائح خلوية متزججة من أجل تدفقات عمل التصوير اللاحقة.
- يضمن تكرارية سمك العينة وجودتها، وهو أمر بالغ الأهمية للمقاييس البنيوية الكمية.
- يتيح إجراء مقارنة موثوقة للحالات الخلوية أو الاضطرابات في حملات الفحص.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- يربط الرؤى الهيكلية بنماذج خلوية ذات صلة بالمرض مثل Saccharomyces cerevisiae.
- يدعم الاستمرارية من مرحلة الاكتشاف وصولاً إلى التحقق قبل السريري من خلال تمكين التحليل في الموقع (in situ) للآليات الخلوية.
- يقلل من مخاطر الترجمة من خلال توفير بيانات هيكلية عالية الدقة لتقييم المؤشرات الحيوية أو الأهداف العلاجية.
تكامل مسار العمل ومنظومة التشغيل
يدمج هذا البروتوكول المراحل بدءاً من الاكتشاف المبكر وصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة والأبحاث قبل السريرية، مما يوفر جسراً يربط بين الفرضية الجزيئية والتحقق الخلوي.
- بيولوجيا الاكتشاف: تعزيز اختبار الفرضيات من خلال تمكين الاستجواب الهيكلي المباشر للمكونات الداخلية للخلايا.
- الفحص: توفير شرائح (lamellae) قابلة للتكرار ومناسبة لدراسات التصوير المقارن أو عالية الإنتاجية.
- التحليلات: توليد بيانات تصويرية مقطعية كمية لإجراء تحليل إحصائي قوي ومقارنة الظروف.
- البحث الانتقالي: الحفاظ على الاستمرارية من خلال دعم أنظمة النماذج ذات الصلة بالأمراض ومواءمة المؤشرات الحيوية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: وضع سير عمل قابل لإعادة الاستخدام ويمكن تطويعه لأنواع مختلفة من الخلايا حقيقية النواة والأسئلة البحثية المتنوعة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية وتقلل من الغموض الآلي في التحقق من صحة الأهداف.
- القيمة التشغيلية: توحد عمليات تحضير العينات والتصوير، مما يعزز قابلية التكرار وقابلية التوسع.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن عملية اتخاذ القرارات بشأن المضي قدماً أو التوقف (go/no-go) وكفاءة رأس المال من خلال توفير بيانات هيكلية عالية المحتوى في مرحلة مبكرة من المسار.
- التأثير على المحفظة: تتيح تحديد الأولويات المعدلة وفقاً للمخاطر والنهوض بالأهداف التي تم التحقق من صحتها هيكلياً.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM)، وتشغيل الحزمة الأيونية المركزة/المجهر الإلكتروني الماسح (FIB/SEM)، وتزجيج العينات.
- يتطلب الوصول إلى أجهزة متخصصة وبنية تحتية مبردة.
- يستلزم توحيداً دقيقاً للمعايير بين الفرق لضمان تحضير شرائح (lamellae) قابلة للتكرار.
- قابل للتكيف مع نماذج حقيقية النواة متنوعة، ولكن قد يتطلب تحسيناً للبروتوكول لأنواع الخلايا المختلفة.
- يعد التحكم في سمك العينة والتلوث أمراً بالغ الأهمية لنجاح التصوير في المراحل اللاحقة.
