تجميع درجة الحرارة التي تسيطر عليها وتوصيف ثنائي واجهة قطرة
April 19th, 2021
يفصل هذا البروتوكول استخدام نظام تسخين يتم التحكم في درجة حرارته لتعزيز تجميع الطبقة الأحادية الدهنية وتشكيل طبقة ثنائية واجهة القطيرات للدهون ذات درجات حرارة ذوبان مرتفعة ، وقياسات السعة لتوصيف التغيرات التي تحركها درجة الحرارة في الغشاء.
يمكن هذا البروتوكول الباحثين من تسخين طبقة ثنائية واجهة القطيرات بدقة ، أو DIB ، غشاء النموذج ، والذي يسمح بدراسة مجموعة متنوعة من الآثار المتعلقة بدرجة الحرارة التي تحدث في البيئات الخلوية. وتنبع الميزة الأساسية من القدرة على قياس درجة حرارة الحمام والتحكم فيها محليا في خزان منخفض الحجم دون عرقلة الوصول إلى التوصيفات الكهربائية أو البصرية للبنك. القدرة على تسخين حمام السوائل بدقة يفتح إمكانية لدراسة خصائص النقل والإشارات في DIBs شكلت من مجموعة متنوعة من مكونات الغشاء، بما في ذلك المستخلصات الخلوية الطبيعية.
هذا بروتوكول متعدد الخطوات يستفيد من معدات متعددة يجب متابعتها عن كثب لتحقيق دقة تجريبية كافية ، وبالتالي يمكن توضيح أي غموض في العملية المكتوبة من خلال العرض التوضيحي البصري. للبدء في جمع قطعتين من المطاط العازل سمكها ملليمتر واحد قلصت إلى 25 في 40 ملليمتر في الطول، قطعتين من المطاط سمكها ستة ملليمترات التي هي أيضا 25 في 40 ملليمتر، وإعداد قاعدة الألومنيوم جدول المباريات، وخزان زيت الاكريليك الذي يناسب في نافذة عرض لاعبا اساسيا قاعدة الألومنيوم. ضع القطع المطاطية الرقيقة على مرحلة المجهر بحيث تكون الحافة الطويلة لكل قطعة عرضية لفتح المرحلة.
وضع لاعبا اساسيا قاعدة الألومنيوم على رأس منصات عازلة مع نافذة عرض لاعبا اساسيا تركزت فوق العدسة الهدف. ضع قطعة مطاطية أكثر سمكا فوق كل عنصر تدفئة مقاوم ، ثم استخدم مقطع مرحلة المجهر لعقده في مكانه لحماية عناصر التدفئة من التلف الناجم عن مقاطع المسرح وللعزل ضد التقصير الكهربائي العرضي. ثني بعناية نهاية القياس من الحرارية لتحقيق زاوية 90 درجة في حوالي أربعة ملليمترات من النهاية.
إدراج طرف عازمة من الحرارية في الزاوية اليسرى السفلى من لاعبا اساسيا الألومنيوم وتأمين بلطف مع المسمار قفل. ضع خزان الاكريليك في بئر من لاعبا اساسيا الألومنيوم قبل إضافة زيت الهيكساديكان إلى بئر لاعبا اساسيا الألومنيوم لتقليل خطر محاصرة فقاعات الهواء بين نافذة المشاهدة والجزء السفلي من خزان الاكريليك. الاستغناء عن 1,000 ميكرولتر من زيت الهيكسادكان في بئر لاعبا اساسيا الألومنيوم لتوفير مساحة سطح أقصى لنقل الحرارة أن يحدث في حين لا يسمح للنفط لتسرب على حواف لاعبا اساسيا على مرحلة المجهر أو عدسة الهدف.
الاستغناء عن حوالي 1000 ميكرولتر من زيت الهيكساديكان في خزان الاكريليك دون ملء ذلك. قياس السعة الاسمية للغشاء مع خفض درجة حرارة حمام الزيت من نقطة محددة تسمح بتكوين طبقة ثنائية لتحديد انتقالات المرحلة الحرارية للدهون في الغشاء. انقر بزر الماوس الأيمن فوق الرسم البياني لدرجة الحرارة على واجهة المستخدم الرسومية ومسح بيانات العرض لضمان توفر مساحة كافية في المخزن المؤقت للتسجيلات اللاحقة.
باستخدام مولد الموجي متصلة مكبر للصوت المشبك التصحيح، وتطبيق الموجي الجهد الثلاثي عبر ثنائي الطبقة واجهة قطرة، أو DIB، والأقطاب الكهربائية وتسجيل الاستجابة الحالية المستحثة من خلال طبقة ثنائية. تبريد طبقة ثنائية عن طريق خفض درجة حرارة مجموعة نقطة في زيادات خمس درجات، والانتظار لمدة لا تقل عن خمس دقائق في درجة حرارة ثابتة الدولة الجديدة بين التغيرات في درجة الحرارة حتى يتم تحقيق درجة الحرارة المطلوبة. بعد حمام الزيت وتبريد الطبقة الثنائية إلى الحد الأدنى المطلوب من درجة الحرارة ، انقر بزر الماوس الأيمن فوق الرسم البياني لدرجة الحرارة في واجهة المستخدم الرسومية مرة أخرى وتصدير بيانات درجة الحرارة مقابل الوقت إلى برنامج جدول البيانات.
إيقاف التسجيل الحالي. من التيار المقاس، احسب السعة الاسمية للاستجابة الحالية للموجة المربعة مقابل الوقت خلال فترة التبريد. رسم السعة الاسمية مقابل درجة الحرارة لمراقبة كيفية تغير سعة الغشاء ، ثم تحديد التغيرات غير الرتابة في السعة مقابل درجة الحرارة لتحديد درجة حرارة الذوبان.
وبالمثل، تقييم السعة شبه ثابتة محددة من طبقة ثنائية في درجات حرارة ثابتة عن طريق زيادة متتالية في درجة حرارة حمام الزيت ومنطقة ثنائية الطبقات. تغيير درجة حرارة نقطة مجموعة في زيادات 10 درجة مئوية باستخدام واجهة المستخدم الرسومية والسماح للنظام إلى التوازن إلى درجة الحرارة الجديدة. تنفيذ الخطوات التي سبق وصفها لبدء قياس التيار بالسعة والتسجيل.
تغيير منطقة ثنائي الطبقة عن طريق ضبط بعناية مواقف الأقطاب الكهربائية باستخدام المتلاعبين الصغيرة. السماح لموجة تيار مربع للوصول إلى سعة حالة ثابتة وجمع الصور من DIB لتمكين حساب منطقة الغشاء مقابل الوقت. استخدام كاميرا محمولة على المجهر لتصوير طبقة ثنائية كما رأينا من الفتحة.
إضافة علامة رقمية إلى برنامج التسجيل الحالي لوضع علامة على النقطة الزمنية المقابلة لجمع الصور. الحصول على ما مجموعه خمس صور DIB والمناطق ثابتة الحالة من تيار ثنائي الطبقة، ثم إعادة تعيين درجة الحرارة وتكرار التصوير. تحليل التسجيلات الحالية والصور DIB في النقاط الزمنية الموسومة المقابلة لمناطق ثنائية المستوى الدولة ثابتة، استخراج سعة ثنائية الطبقة ومنطقة لكل درجة حرارة.
مؤامرة السعة مقابل مساحة لكل درجة حرارة وحساب المنحدر من الانحدار من الدرجة الأولى، والذي يمثل سعة محددة من طبقة ثنائية في كل درجة حرارة. ثم رسم قيم من سعة محددة مقابل درجات الحرارة الخاصة بهم. فحص السعة المحددة مقابل بيانات درجة الحرارة للتغيرات غير الرتابة لتحديد درجات الحرارة الذائبة.
تقييم ديناميات تشكيل قناة الأيونات التي تعتمد على الجهد عن طريق توليد مدخلات خطوة الجهد DC عبر طبقة ثنائية. تعيين الجهد الأولي لقيمة الخطوة المطلوبة في millivolts والجهد النهائي وحجم الخطوة إلى قيمة أعلى من الخطوة المطلوبة. تعيين مدة الوقت المطلوب لإدخال الخطوة في ثوان، ثم اختر القطبية المطلوبة لإدخال الخطوة.
تبديل مكبر للصوت المشبك التصحيح لإرسال الجهد الأمر الناشئة من عرض المختبر أو وحدة إخراج الجهد إلى مرحلة الرأس، بدوره على الجهد وتسجيل الاستجابة الحالية المستحثة، والتي ينبغي أن تمنع استجابة على شكل حرف S إلى الجهد الحرجة. الحصول بشكل منفصل على علاقات الجهد الحالي الديناميكية لغشاء في درجات الحرارة المطلوبة للكشف عن العلاقات التي تعتمد على الجهد مثل سلوكيات قناة أيون. قم بتبديل مكبر الصوت المشبك التصحيح لإرسال الجهد الأمر الناشئة من مولد الموجي إلى مرحلة الرأس وبدء التسجيلات الحالية.
على مولد الموجي، إخراج الموجي الجيبي المستمر مع السعة المطلوبة، والإزاحة، والتردد. سجل الاستجابة الحالية المستحثة عبر دورة واحدة أو عدة دورات وكرر حسب الرغبة لاتساع الموجات والترددات ودرجات الحرارة المختلفة. تم استخدام نظام التحكم في درجة الحرارة لعرض الاعتماد على درجة الحرارة من DIB التي تشكلت من استخراج الدهون الإجمالية في الدماغ، أو BTLE، الدهون.
وتظهر قياسات التيار السعوي ودرجة الحرارة مقابل الوقت خلال دورة التدفئة من درجة حرارة الغرفة إلى ما يقرب من 60 درجة مئوية. وتم توثيق التغيرات في السعة الاسمية مقابل درجة الحرارة عبر دورة تبريد/تسخين كاملة، بعد تشكيل ثنائي الطبقة الأولي عند 60 درجة مئوية. ويمكن استخدام قياسات شبه ثابتة لسعة محددة في درجات حرارة مختلفة لتحديد درجة حرارة ذوبان الدهون.
رسم سعة منطقة ثنائية الطبقة مقابل ثنائية الطبقة يسمح بالتراجع الخطي، حيث يمثل الميل قيمة السعة المحددة. تظهر صورة DIB أنه عندما تكون درجة الحرارة أقل من درجة حرارة الذوبان ، يعتمد الغشاء حالة لاصقة للغاية ، حتى في ظل التوتر من قطرات ممتدة تسببها أقطاب كهربائية منفصلة بشكل جيد. تم الحصول على آثار التيار مقابل الجهد الموضحة عن طريق تطبيق الفولتية الغشاء الجيوب الأنفية، وقياس التيار المستحث في اثنين من درجات الحرارة المختلفة.
تساعد الأسهم والأرقام اللاحقة في تصور الأرباع المتعاقبة من الجهد الجيبي فيما يتعلق بالوقت. تظهر الكثافة الحالية المقاسة لغشاء BTLE المخدر بالمونازوميسين على نفس مستوى الجهد ودرجات حرارة مختلفة اثنين هنا. من المهم الاستغناء عن زيت الهيكساديكان في بئر لاعبا اساسيا الألومنيوم بشكل صحيح.
إذا تم ذلك خارج التسلسل أو ليس بعناية ، فإن فقاعات الهواء تتشكل تحت بئر الأكريليك ، مما سيعرقل الرؤية من أسفل إلى أعلى ل DIB. يجب على المستخدم أيضا تذكر لمسح المخزن المؤقت للبيانات في برنامج التحكم في درجة الحرارة قبل كل قياس لضمان التسجيل الكامل. يسمح هذا الإجراء بتميز الأغشية المحاكاة الحيوية عبر مجموعة من درجات الحرارة ، وهو أمر ضروري لدراسة الاعتماد على درجة الحرارة لهيكل الغشاء والنقل.
وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذه القدرة للكشف عن الآثار النانوية للأنواع الأخرى النشطة في الأغشية، مثل القنوات الأيونية البيولوجية والمواد النانوية المهندسة.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
يُمكِّن هذا البروتوكول التسخين الدقيق لواجهة ثنائية الطبقات (DIB) في غشاء نموذجي، مما يسهل دراسة التأثيرات المرتبطة بدرجة الحرارة في البيئات الخلوية. يسمح بقياس وتحكم محلي في درجة حرارة الحمام دون إعاقة الوصول للتوصيفات الكهربائية أو البصرية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- الفيزياء الحيوية
- بيولوجيا الغشاء
الخلفية
- تركز الدراسة على تجميع طبقة أحادية من الدهون وتكوين واجهة ثنائية الطبقات.
- التحكم في درجة الحرارة أمر بالغ الأهمية للتحقيق في خصائص الغشاء.
- تُستخدم قياسات السعة لتقييم التغييرات المدفوعة بدرجة الحرارة.
- يمكن استخدام المستخلصات الخلوية الطبيعية كمكون للغشاء.
غرض الدراسة
- لتعزيز تجميع طبقة أحادية من الدهون وتكوين واجهة ثنائية الطبقات.
- لتحقيق تأثيرات مرتبطة بدرجة الحرارة على سلوك الغشاء.
- لتعزيز الدقة التجريبية من خلال التحكم الدقيق في درجة الحرارة.
الطرق المستخدمة
- نظام تسخين بتحكم في درجة الحرارة وردود الفعل.
- قياسات السعة لتوصيف الأغشية.
- بروتوكول متعدد الخطوات مع متطلبات معدات محددة.
- عروض مرئية لتوضيح الغموض الإجرائي.
النتائج الرئيسية
- تجميع ناجح للطبقات الأحادية من الدهون والواجهات الثنائية الطبقات.
- القدرة على دراسة مجموعة أكبر من مكونات الغشاء.
- فهم معزز لخصائص النقل والإشارات.
- دقة مثبتة في التحكم في درجة الحرارة أثناء التجارب.
الاستنتاجات
- يوفر البروتوكول طريقة موثوقة لدراسة الواجهات الثنائية الطبقات.
- التحكم في درجة الحرارة ضروري للحصول على نتائج تجريبية دقيقة.
- يمكن للدراسات المستقبلية الاستفادة من هذه الطريقة في أبحاث الغشاء المتنوعة.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Temperature-controlled assembly and characterization of droplet interface bilayers (DIBs) enables biopharma R&D teams to interrogate membrane structure and function using lipid compositions that closely mimic cellular diversity. This approach expands predictive confidence in early discovery by supporting mechanistic de-risking and target validation in physiologically relevant model membranes. The method enhances portfolio decision-making by enabling robust, quantitative assessment of membrane-active compounds across a broader range of lipid environments.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic interrogation of membrane-active targets in biologically relevant lipid contexts.
- Supports functional target validation by quantifying temperature-dependent membrane properties.
- Facilitates predictive de-risking of candidate molecules acting on diverse membrane systems.
- Improves confidence in early-stage triage by revealing phase transitions and structural dynamics.
Screening & Assay Development
- Prepares validated model membranes for downstream compound screening workflows.
- Standardizes assay conditions by controlling temperature and lipid composition.
- Delivers reproducible, quantitative capacitance and current measurements for reliable evaluation.
- Enables scalable adaptation to different lipid mixtures, including natural extracts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns model membrane studies with disease-relevant lipid heterogeneity.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling phase transition analysis.
- Provides risk-adjusted data for advancing membrane-targeted therapeutics.
- Facilitates investigation of nanoscale effects of ion channels and engineered nanomaterials.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, mechanistic de-risking, and quantitative analytics in membrane biology.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing and pathway clarification in membrane-active target studies.
- Screening: Provides assay-ready, temperature-controlled model membranes for compound evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative capacitance and current readouts for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical work by modeling natural lipid phase transitions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse membrane composition studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in membrane-targeted programs.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of membrane assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust early-stage data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of membrane-active assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, membrane biophysics, and temperature-controlled instrumentation.
- Needs access to patch clamp amplifiers, waveform generators, and optical imaging systems.
- Demands rigorous cross-team standardization of temperature and measurement protocols.
- Adaptable to a range of lipid mixtures, including synthetic and natural extracts.
- Careful oil dispensing and data management are critical to avoid measurement artifacts.
