بروتوكول تحضير العينات ونقلها لعلم البلورات طويل الطول الموجي داخل الفراغ على خط الشعاع I23 في مصدر ضوء الماس
April 23rd, 2021
هنا ، نقدم بروتوكولا لإعداد العينات المبردة ونقل البلورات إلى المحطة النهائية الفراغية على خط الشعاع I23 في Diamond Light Source ، لتجارب علم البلورات بالأشعة السينية الجزيئية الكبيرة طويلة الطول الموجي.
يستغل علم البلورات الجزيئية الكبيرة طويل الطول الموجي الإشارة الشاذة من ذرات الضوء الموجودة أصلا في البروتينات والأحماض النووية. تستخدم هذه التقنية لحل مشكلة الوجه البلوري تجريبيا وتحديد هوية وموقع هذه العناصر. Beamline I23 في Diamond Light Source هي أداة سنكروترون فريدة من نوعها محسنة للتجارب بأطوال موجية طويلة تصل إلى خمسة أنغستروم.
يسمح بالوصول إلى حواف امتصاص العناصر ذات الأهمية البيولوجية العالية ، مثل الكالسيوم والبوتاسيوم والكلور والكبريت والفوسفور. نظرا للامتصاص الكبير للأشعة السينية عن طريق الهواء في نظام الطول الموجي الطويل ، يتم إجراء هذه التجارب في بيئة فراغية. للحفاظ على العينات في درجات حرارة مبردة داخل بيئة الفراغ، يتم تركيب البلورات على حاملات عينات مخصصة وموصلة حراريا.
إن نقل العينة المبردة من النيتروجين السائل إلى محطة نهاية الفراغ يشبه إلى حد كبير التقنيات المستخدمة في المجهر الإلكتروني المبرد. يعرض هذا البروتوكول إجراءات نقل البلورات إلى بيئة الفراغ باستخدام الأدوات والمعدات التي تم تطويرها في Diamond Light Source. ابدأ بفصل الغطاء عن قاعدة CombiPuck بحيث يظل حاملو العينات متصلين بالقاعدة ويتم الاحتفاظ بالقوارير في الغطاء.
اغمر الغطاء بقوارير في النيتروجين السائل ، ثم قم بتوصيل حامل عينة ومحول بعصا مغناطيسية وحصاد البلورات. قم بتبريد كل عينة مباشرة في CombiPuck ، مع ملاحظة موضع العينة. لإغلاق العفريت ، استخدم عصا عفريت لتوصيل القاعدة بالغطاء.
انقل CombiPuck من النيتروجين السائل إلى الشاحن الجاف أو التخزين. ضع قاعدة عفريت الكتلة المملوءة بالفعل بكتل نقل فارغة على قاعدة الدعم الخاصة بها في حاوية رغوة ، ثم املأها بالنيتروجين السائل. ثم ، ضع CombiPuck في حاوية الرغوة المملوءة بالنيتروجين السائل ، مع التأكد من تأمين قاعدة العفريت على الحامل المغناطيسي داخل حاوية الرغوة.
قم بتبريد جميع الأدوات اللازمة مسبقا في النيتروجين السائل. بعد ذلك ، افصل الغطاء عن القاعدة باستخدام أداة فاصل العفريت على الإعداد العالي ، بحيث تظل القاعدة متصلة بالحامل المغناطيسي ، مما يعرض حاملات العينات داخل النيتروجين السائل. ضع عصا الفاصل فوق حامل العينة والمحول إلى الأسفل قدر الإمكان، مع التأكد من أن العصا عمودية.
حرك الذراع الصغيرة الموجودة على عصا الفاصل لأسفل باستخدام إبهامك حتى ينقر لتأمين حامل العينة في الداخل، واسحب حامل العينة من المحول. اخفض الفاصل فوق موضع كتلة النقل المطلوب، مع التأكد من أن أحد الشقوق الثلاثة يتناسب داخل الفتحة المركزية لكتلة النقل. حرر حامل العينة عن طريق تحريك الذراع احتياطيا.
لتحميل العينات في كتلة النقل التالية، استخدم أداة المفتاح الدوار لتدوير كتلة نقل فارغة في الموضع الأفقي. بمجرد نقل جميع حاملي العينات ، أغلق عفريت الكتلة عن طريق وضع الغطاء في النيتروجين السائل. انتظر حتى تتوازن درجة الحرارة ، ثم ضع الغطاء فوق القاعدة وارفعه برفق للإفراج عن الدوار.
قم بإرفاق المكوك بالمحطة. افتح صمامات غاز النيتروجين والهواء وتأكد من تدفق الغازات. ثم قم بتشغيل CTS.
قم بتبريد كل من الحمام والمكوك بالنيتروجين السائل. ضع القمع المرفق في منفذ التعبئة على المكوك وصب النيتروجين السائل ببطء في القمع أثناء مراقبة المستوى على الشاشة. توقف عندما يتحول المؤشر من الأحمر إلى الأزرق.
املأ الحمام بالنيتروجين السائل باستخدام القمع. انقل عفريت كتلة من النيتروجين السائل إلى حمام CTS باستخدام أداة فصل العفريت المرفقة. قم بإزالة غطاء عفريت الكتلة وأغلق غطاء حمام CTS.
لإدخال كتلة نقل في المكوك ، افتح مقبض المكوك عن طريق تدوير 90 درجة في اتجاه عقارب الساعة ودفعه نحو الحمام بحيث يفرض المسار المصحوب على المقبض المسار الصحيح للسفر. بمجرد تبريد غطاء الكتلة ، قم بإدخال المقبض لإدخال الكتلة في المكوك. لقفل كتلة النقل على المكوك، قم بتدوير المقبض 180 درجة في اتجاه عقارب الساعة.
اسحب المقبض إلى الوضع الخلفي الأصلي ، وقم بتثبيته في مكانه عن طريق تدوير 90 درجة عكس اتجاه عقارب الساعة. اضغط على إغلاق مضخة صمام المكوك على شاشة العرض لبدء إخلاء المكوك. بمجرد أن تكون الرسائل المكوك جاهزة للتحرك ولا تحرك قضيبا ، يتم عرض الصمام المغلق على الشاشة التي تعمل باللمس ، اضغط على الذراع أسفل المكوك وارفعه بعناية باستخدام المقبض الموجود في الأعلى.
احمل المكوك إلى القفل الهوائي في محطة نهاية الفراغ في وضع مستقيم وقم بإرفاقه. حدد موضع كتلة فارغة داخل الوعاء عن طريق الضغط على الزر المقابل على الشاشة التي تعمل باللمس ونقل فندق العينة إلى موضع التحميل الصحيح. بمجرد أن يكون فندق العينة في موضعه، اضغط على الزر فتح لبدء تسلسل التعشيق الفراغي.
بعد اكتمال التسلسل وتغيير الحالة إلى Airlock مفتوحة ، قم بحظر المكوك ، وقم بلف المقبض 90 درجة في اتجاه عقارب الساعة لفتح القضيب. ادفع القضيب برفق إلى داخل السفينة بحيث يفرض المسار الموجه المسار الصحيح للسفر نحو فندق العينة. أدخل كتلة النقل ببطء في الفندق باستخدام موجز الفيديو المعروض على الشاشة للحصول على إرشادات ، مما يضمن تنشيط رمز موضع الكتلة على شاشة اللمس.
بمجرد تنشيطه ، قم بتدوير المقبض 180 درجة عكس اتجاه عقارب الساعة لتحرير كتلة النقل وسحب القضيب من الوعاء. بمجرد التراجع الكامل ، قم بتدوير المقبض 90 درجة عكس اتجاه عقارب الساعة لقفل القضيب. اضغط على الزر إغلاق لإغلاق صمام تفريغ المحطة النهائية وتنفيس المسافة بين المكوك والوعاء إلى الضغط الجوي.
قم بإزالة المكوك عندما تعرض شاشة قفل الهواء الحالة موافق على الانفصال. أعد المكوك إلى حمام CTS واضغط على Open Shuttle Valve لإخلاء المكوك قبل تحميل كتلة العينة التالية. بمجرد أن تصبح إشارة المرور خضراء وتظهر الرسالة موافق على تحريك قضيب ، يمكن إدخال كتلة النقل التالية إلى المكوك.
لإعداد كتلة النقل التالية ، قم بتدوير عفريت الكتلة داخل الحمام. ادفع مفتاح الدوران المدمج في الجزء العلوي من غطاء الأكريليك لأسفل في القفل الموجود في وسط عفريت الكتلة. أثناء الضغط عليه لأسفل، أدر المفتاح لوضع كتلة النقل المطلوبة في وضع الالتقاط.
بمجرد نقل جميع الكتل ، تأكد من فتح صمام المكوك ، واضغط على زر الخبز على الشاشة التي تعمل باللمس ، وحدد كل من الحمام والمكوك ، ثم اضغط على بدء الخبز. يمكن لخط البلورات الجزيئية الكبيرة طويل الطول الموجي I23 في Diamond Light Source الوصول إلى حواف امتصاص العناصر ذات الأهمية البيولوجية العالية ، مثل الكالسيوم والبوتاسيوم والكلور والكبريت والفوسفور ، مما يعطي إشارة شاذة محسنة يمكن استخدامها للمراحل أو تحديد موقع هذه العناصر داخل الجزيئات الكبيرة. تم جمع بيانات الحيود من بلورة ثاوماتين واحدة عند الطول الموجي 2.75 أنغستروم ، تم اختيارها كحل وسط بين زيادة الإشارة الشاذة وتأثيرات امتصاص العينات عند الأطوال الموجية الأطول.
يضمن إعداد التفريغ وصول الأشعة السينية المتناثرة بواسطة العينة فقط إلى الكاشف ، مما يوفر خلفية منخفضة حول انعكاسات براج. أسفرت مجموعة البيانات عن إشارة شاذة قوية للغاية ، مما سهل حل الهيكل بواسطة خط أنابيب التدرج التلقائي CRANK2. مكنت الجودة العالية لخريطة كثافة الإلكترون الناتجة من بناء نموذج أوتوماتيكي ناجح ، مع وضع صحيح ل 100٪ من تسلسل الأحماض الأمينية للثاوماتين.
تشكل بقايا السيستين ال 16 داخل الثوماتين ثمانية جسور ثاني كبريتيد ، وكلها مرئية بوضوح في خريطة كثافة الإلكترون. نظرا لأن علم البلورات البروتيني طويل الطول الموجي في الفراغ هو مجال جديد ، فقد طورنا أدوات ومعدات جديدة للتعامل مع العينات. يوجه هذا البروتوكول المستخدمين في نقل العينات بأمان إلى محطة نهاية الفراغ على خط الشعاع I23 في Diamond Light Source.
تفتح بيئة الفراغ فرصا فريدة لإجراء تجارب الحيود في نطاق الطول الموجي الذي لا يمكن الوصول إليه في خطوط الحزم الأخرى. يتيح علم البلورات بالأشعة السينية طويل الطول الموجي التدرج التجريبي للجزيئات الكبيرة مباشرة من البلورات الأصلية. كما يسمح بتحديد لا لبس فيه للأيونات المرتبطة بالجزيئات.
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولاً مفصلاً لتحضير العينات بالتبريد ونقل البلورات إلى محطة نهاية الفراغ على خط الحزمة I23 في مصدر الضوء الماسي. ينصب التركيز على تجارب البلورات بالأشعة السينية للجزيئات الكبيرة ذات الطول الموجي الطويل، والتي تستفيد من الإشارات الشاذة من الذرات الخفيفة في الجزيئات الحيوية الكبيرة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بلورات الجزيئات الكبيرة
- علم الأحياء البنيوي
- تقنيات إشعاع السنكروترون
الخلفية
- بلورات الجزيئات الكبيرة ذات الطول الموجي الطويل تستخدم الإشارات الشاذة من الذرات الخفيفة.
- خط الحزمة I23 مُحسّن لتجارب الطول الموجي الطويل، مما يتيح الوصول إلى العناصر البيولوجية الحرجة.
- يتم إجراء التجارب في فراغ لتخفيف امتصاص الأشعة السينية بواسطة الهواء.
- يتم الحفاظ على درجات الحرارة بالتبريد باستخدام حوامل عينات متخصصة.
هدف الدراسة
- لتوفير بروتوكول شامل لنقل البلورات إلى بيئة فراغ.
- لضمان سلامة العينات أثناء عملية النقل.
- لتسهيل تجارب البلورات بالأشعة السينية ذات الطول الموجي الطويل.
الطرق المستخدمة
- فصل غطاء CombiPuck عن القاعدة للوصول إلى العينة.
- انغماس العينات في النيتروجين السائل للتحفظ بالتبريد.
- استخدام أداة فاصل الأقراص لنقل العينات بدقة.
- تنفيذ بيئة فراغ خاضعة للرقابة لإدخال العينة.
النتائج الرئيسية
- نقل ناجح للبلورات المحفوظة بالتبريد إلى محطة نهاية الفراغ.
- تبرهن على فعالية البروتوكول في الحفاظ على سلامة العينة.
- التحقق من الإجراء لبلورات الجزيئات الكبيرة ذات الطول الموجي الطويل.
- تأسيس طريقة موثوقة للتجارب المستقبلية في مصدر الضوء الماسي.
الاستنتاجات
- يوفر البروتوكول إطارًا قويًا لنقل العينات بالتبريد.
- يعزز من جدوى تجارب البلورات بالأشعة السينية ذات الطول الموجي الطويل.
- يمكن للتطبيقات المستقبلية أن تبني على هذه المنهجية لدراسات بيولوجية مختلفة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
In-vacuum long-wavelength macromolecular crystallography on beamline I23 enables direct experimental phasing and native ion identification in proteins and nucleic acids, eliminating the need for external labeling. This capability enhances predictive confidence in structural biology, supporting early discovery and target validation inflection points across biopharma portfolios. The protocol's reproducibility and data quality facilitate risk-adjusted advancement of structural targets for downstream drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct structure solution of macromolecules using native anomalous scatterers for robust target validation.
- Supports mechanistic de-risking by unambiguously identifying biologically relevant ions and cofactors.
- Improves predictive confidence in target structure and binding site characterization.
Screening & Assay Development
- Provides high-quality, reproducible structural data for assay development and compound screening campaigns.
- Facilitates standardization of sample preparation and transfer workflows across research teams.
- Enables reliable evaluation of ligand binding and structural perturbations in validated systems.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural insights with disease-relevant systems by resolving native ion binding and post-translational modifications.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by preserving sample integrity and data quality.
- Supports translational biomarker identification through precise structural mapping.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing to lead identification and preclinical validation, leveraging in-vacuum crystallography for high-confidence structural outputs.
- Discovery Biology: Advances hypothesis testing and pathway clarification by enabling native anomalous phasing and ion identification.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative diffraction data supporting assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Provides robust statistical outputs and electron density maps for comparative analysis of structural conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical research by maintaining sample fidelity and enabling biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable workflow for structural studies across multiple targets and programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target structures.
- Operational Value: Standardizes sample handling and transfer, ensuring reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk through high-quality structural data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryogenic sample handling and macromolecular crystallography.
- Demands access to specialized instrumentation, including the Cryogenic Transfer System and vacuum-compatible sample holders.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation and transfer protocols.
- Adaptation may be needed for different macromolecular systems or crystal morphologies.
- Practical limitations include the need for vacuum-compatible infrastructure and specialized training.
