تحليل تكوين الدهون من البكتيريا الفطرية من قبل طبقة رقيقة الكروماتوغرافيا
أبريل 16, 2021
يتم تقديم بروتوكول لاستخراج المحتوى الكلي للدهون من جدار الخلية من مجموعة واسعة من البكتيريا الفطرية. وعلاوة على ذلك، يتم عرض بروتوكولات استخراج وتحليل أنواع مختلفة من الأحماض الميكوليك. كما يتم توفير بروتوكول كروماتوغرافي طبقة رقيقة لرصد هذه المركبات البكتيرية mycobacterial.
الدهون Mycobacteria هي سمة هامة من جنس وحاسمة في التفاعلات Mycobacteria المضيف. السرعة وبراعة هي المزايا الرئيسية لهذا الإجراء. يمكن استخدام هذه الطريقة لفهم دور الدهون وإمراض البكتيريا الفطرية وتأثيرها المناعي.
لاستخراج الدهون المرتبطة غير التساهمية، إضافة 15 ملليلتر من واحد إلى اثنين من الكلوروفورم إلى محلول الميثانول إلى أنبوب زجاجي مع غطاء المسمار بطانة PTFE تحت غطاء تدفق صفح. ثم، خدش 200 ملليغرام من البكتيريا الفطرية من وسط صلب، وإضافة البكتيريا الفطرية إلى الأنبوب الزجاجي. احتضان أنبوب بين عشية وضحاها مع التحريك المستمر.
في اليوم التالي، قم بتصفية المذيبات العضوية من خلال قمع زجاجي مبطن بورق فلتر في أنبوب زجاجي. بعد استخدام تدفق غاز النيتروجين ، لتبخر المرحلة السائلة في الأنبوب ، قم بملء الأنبوب بغاز النيتروجين ، لتخزين الأنبوب في أربع درجات مئوية. ثم، إضافة 15 ملليلتر من الكلوروفورم اثنين إلى واحد إلى محلول الميثانول إلى الحطام الخلوي واحتضان الأنبوب بين عشية وضحاها مع التحريك المستمر.
في صباح اليوم التالي، والسماح للخليط للراحة لمدة ساعة واحدة، قبل استخدام ماصة باستور لنقل المذيبات العضوية في ورقة تصفية اصطف قمع الزجاج في نفس أنبوب جمع الزجاج. ثم، تتبخر المرحلة السائلة كما هو موضح، قبل إعادة ملء أنبوب مع غاز النيتروجين لتخزين أربع درجات مئوية. لاستخراج حمض ميكوليك، إضافة 2-5 ملليلتر من محلول stirifying و 200 ملليغرام من الكتلة الحيوية mycobacteria إلى أنبوب زجاجي محكم مع غطاء المسمار بطانة PTFE، وخلط محتويات عن طريق الدوامة.
احتضان الخليط داخل حمام جاف في 80 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، عندما يبرد الأنبوب درجة حرارة الغرفة، أضف ملليلترين من الهيكسان N، وخلط المحتويات لمدة 30 ثانية عن طريق الدوامة. السماح للأنبوب لتسوية حتى مرحلتين واضحة تظهر ونقل المرحلة العليا N hexane إلى أنبوب جديد.
اخلط ملليلترين إضافيين من N hexane مع محتويات الأنبوب واجمع الطبقة العليا مرة أخرى. ثم، تتبخر محتويات أنبوب عن طريق تدفق النيتروجين وتخزين العينة المغطاة بالنيتروجين في أربع درجات مئوية كما هو موضح. لتحليل العينات من قبل TLC تغطي جدار واحد من غرفة TLC مع قطعة من ورقة تصفية، إضافة الفازلين على زوايا الغرفة لختم الغرفة، يمكن للخليط المذيبات على ورقة تصفية وإضافة حجم المتبقية من المذيبات إلى الجزء السفلي من غرفة TLC.
أغلق غرفة TLC لمدة 20 دقيقة على الأقل إلى المشبعة. وفي الوقت نفسه، حل الدهون في الأنبوب الزجاجي في 200 إلى 1000 ميكرولتر من الكلوروفورم واستخدام أنبوب زجاجي شعري لتطبيق 10 ميكرولتر من تعليق الكلوروفورم الدهون مباشرة على لوحة TLC. بعد السماح للعينة بالجفاف لمدة خمس دقائق ، أدخل اللوحة في غرفة TLC المشبعة والسماح للمرحلة المتنقلة بالمرور عبر TLC.
عندما يصل المذيب إلى سنتيمتر واحد من الطرف العلوي من اللوحة ، ضع اللوحة تحت تدفق صفح حتى يجف السيليكا تماما. ثم رش اللوحة المجففة مع 15 إلى 20 ملليلتر من 10٪ من هيدرات حمض الفوسفوريك بيانات المولر في الإيثانول حتى لوحة صفراء زاهية، وتسخين لوحة لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق في 120 درجة مئوية. في هذا التحليل التمثيلي ، تم تحليل حمض الميكوليك المستخرج من مختلف أنواع البكتيريا الفطرية ، من خلال TLC أحادي الأبعاد باستخدام نظامين مختلفين وTLC ثنائي الأبعاد.
كما تم إجراء نوعين من إجراءات الميثيل لتأكيد وجود حمض الميكوليك من النوع الخامس. في كلا النظامين elution، كانت تقع الأحماض الميكوليك تقريبا في منتصف لوحة، على الرغم من أن، بقعة المقابلة لنوع حمض الميكوليك خمسة، لوحظ فقط بعد النسغ. TLC ثنائي الأبعاد يسمح أيضا تحديد أنواع حمض الميكوليك الفردية.
على سبيل المثال، الميكوباكتريا بروماي يعبر فقط نوع واحد الأحماض الميكوليك، mycobacterium bovis BCG يعبر عن النوع الأول والرابع، mycobacterium فورتيوم يعبر عن نوع واحد وخمسة، وabcessus mycobacterium يعبر عن نوع واحد واثنين من ملامح حمض الميكوليك. تم تحليل مقتطفات الدهون الإجمالية من مختلف أنواع البكتيريا الفطرية في وظيفة قطبيتها وحجمها. ويكشف أن معظم الدهون القطبية، مثل PDIMs، موجودة في البكتيريا الفطرية بوفيس BCG، ولكن ليس في الميكوباكتريا فورتويتوم، بروماي البكتيريا الفطرية ومورفوتيبي السلس من M abcessus.
الفينولية الجليكوليبيدات موجودة فقط في البكتيريا الفطرية بوفيس BCG، في حين لوحظ جليكوبيبتيدوليبيدس فقط في عينات من البكتيريا الفطرية abcessus. على غرار الأحماض الميكوليكية ، يمكن أيضا تصور Acylglycerols و PDIMs ، PIMs ، بسهولة من خلال تحليل TLC أحادي الأبعاد أو TLC ثنائي الأبعاد. تم استخدام نوعين من البقع للكشف عن PIMs في TLC أحادي الأبعاد.
أهم شيء يجب تذكره عند محاولة هذا البروتوكول هو عدم استخدام أي أدوات بلاستيكية طوال العملية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يقدم هذا المقال بروتوكولاً لاستخراج محتوى الدهون الكلي من جدار خلية أنواع مختلفة من الميكوبكتيريا. كما يوضح أيضًا طرق الاستخراج والتحليل لأنواع مختلفة من الأحماض الميكوليك ويتضمن بروتوكول كروماتوغرافيا طبقي نحيف لمراقبة هذه المركبات.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأحياء الدقيقة
- الكيمياء الحيوية
- المسببات المرضية
الخلفية
- دهون الميكوبكتيريا حاسمة لفهم التفاعلات مع المضيف.
- تلعب هذه الدهون دورًا مهمًا في مسببات الأمراض للميكوبكتيريا.
- فهم استخراج الدهون يمكن أن يساعد في دراسة تأثيراتها التحفيزية للمناعة.
- الطريقة الموصوفة توفر السرعة والتنوع لتحليل الدهون.
هدف الدراسة
- توفير بروتوكول موثوق لاستخراج الدهون من الميكوبكتيريا.
- تحليل دور الأحماض الميكوليك في بيولوجيا الميكوبكتيريا.
- تسهيل البحث في الآليات المسببة للأمراض للميكوبكتيريا.
الطرق المستخدمة
- استخراج الدهون غير المرتبطّة تساهميًا باستخدام الكلوروفورم والميثانول.
- دمج عينات الميكوبكتيريا في عملية الاستخراج.
- الحضانة مع تحريك ثابت لضمان الاستخراج الشامل.
- الكروماتوغرافيا الطبقيّ الرفيع لمراقبة المركبات المستخرجة.
النتائج الرئيسية
- استخراج ناجح لمحتوى الدهون الكلي من جدران خلايا الميكوبكتيريا.
- تحديد أنواع مختلفة من الأحماض الميكوليك من خلال الطرق التحليلية.
- الدليل على فعالية الكروماتوغرافيا الطبقيّ الرفيع في مراقبة المركبات الدهنية.
الاستنتاجات
- البروتوكول المقدم فعال لاستخراج الدهون من الميكوبكتيريا.
- فهم أنماط الدهون يمكن أن يعزز المعرفة بمسببات الأمراض للميكوبكتيريا.
- يمكن تطبيق هذه الطريقة في مزيد من الدراسات حول تفاعلات الميكوبكتيريا مع المضيفين.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Comprehensive lipid profiling of mycobacteria using thin layer chromatography (TLC) enables precise characterization of cell wall components critical for understanding pathogenicity and immunomodulatory potential. This workflow supports early-stage target validation and mechanistic de-risking by distinguishing lipid classes and mycolic acid types across diverse mycobacterial species. The approach enhances predictive confidence for translational research and portfolio triage in infectious disease and immunotherapy pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of lipid-mediated virulence mechanisms and host-pathogen interactions.
- Supports functional target validation by differentiating species-specific lipid signatures.
- Facilitates mechanistic de-risking through direct visualization of mycolic acid and surface lipid diversity.
- Provides actionable data for prioritizing targets with immunomodulatory relevance.
Screening & Assay Development
- Prepares validated lipid extracts for downstream phenotypic or biochemical assays.
- Standardizes TLC-based lipid analysis for reproducible, quantitative comparison across strains.
- Enables scalable screening of lipid profiles to support compound evaluation and lead identification.
- Delivers robust platform for cross-study and cross-species lipidomic benchmarking.
Translational & Preclinical Research
- Aligns lipid biomarker profiles with disease-relevant mycobacterial models.
- Ensures continuity from discovery-stage lipid analysis to preclinical validation of immunomodulatory effects.
- Supports risk-adjusted advancement of candidates targeting lipid-mediated pathways.
- Provides mechanistic insights for translational biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
This TLC-based lipid analysis method integrates from early discovery through preclinical research, enabling hypothesis testing, target validation, and translational biomarker alignment in mycobacterial R&D.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven interrogation of lipid function and diversity in mycobacteria.
- Screening: Provides reproducible, quantitative lipid profiles for assay development and compound screening.
- Analytics: Delivers clear TLC readouts for comparative analysis of lipid classes and mycolic acid types.
- Translational Research: Connects lipidomic findings to disease models and immunomodulatory candidate evaluation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable analytical platform for broad mycobacterial lipid studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in lipid-targeted research.
- Operational Value: Standardizes lipid extraction and TLC analysis for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by clarifying lipid-driven biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of immunomodulatory and anti-infective candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lipid extraction, TLC operation, and interpretation of lipidomic profiles.
- Demands access to organic solvent handling infrastructure and glassware to avoid contamination.
- Necessitates cross-team standardization of extraction and TLC protocols for reproducibility.
- Adaptable to a wide range of mycobacterial species and model systems.
- Plastic instruments must be avoided to prevent interference with organic solvent extraction.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:33
Extraction of The Total Non-Covalent-Linked Lipids from Mycobacteria
2:13
Mycolic Acid Extraction by Acid Methanolysis
3:26
Thin Layer Chromatography (TLC) Analysis
4:57
Results: TLC Analysis of the Lipid Composition in Different Species of Mycobacteria
7:15
Conclusion
