تحليل تكوين الدهون من البكتيريا الفطرية من قبل طبقة رقيقة الكروماتوغرافيا

الدهون Mycobacteria هي سمة هامة من جنس وحاسمة في التفاعلات Mycobacteria المضيف. السرعة وبراعة هي المزايا الرئيسية لهذا الإجراء. يمكن استخدام هذه الطريقة لفهم دور الدهون وإمراض البكتيريا الفطرية وتأثيرها المناعي.

لاستخراج الدهون المرتبطة غير التساهمية، إضافة 15 ملليلتر من واحد إلى اثنين من الكلوروفورم إلى محلول الميثانول إلى أنبوب زجاجي مع غطاء المسمار بطانة PTFE تحت غطاء تدفق صفح. ثم، خدش 200 ملليغرام من البكتيريا الفطرية من وسط صلب، وإضافة البكتيريا الفطرية إلى الأنبوب الزجاجي. احتضان أنبوب بين عشية وضحاها مع التحريك المستمر.

في اليوم التالي، قم بتصفية المذيبات العضوية من خلال قمع زجاجي مبطن بورق فلتر في أنبوب زجاجي. بعد استخدام تدفق غاز النيتروجين ، لتبخر المرحلة السائلة في الأنبوب ، قم بملء الأنبوب بغاز النيتروجين ، لتخزين الأنبوب في أربع درجات مئوية. ثم، إضافة 15 ملليلتر من الكلوروفورم اثنين إلى واحد إلى محلول الميثانول إلى الحطام الخلوي واحتضان الأنبوب بين عشية وضحاها مع التحريك المستمر.

في صباح اليوم التالي، والسماح للخليط للراحة لمدة ساعة واحدة، قبل استخدام ماصة باستور لنقل المذيبات العضوية في ورقة تصفية اصطف قمع الزجاج في نفس أنبوب جمع الزجاج. ثم، تتبخر المرحلة السائلة كما هو موضح، قبل إعادة ملء أنبوب مع غاز النيتروجين لتخزين أربع درجات مئوية. لاستخراج حمض ميكوليك، إضافة 2-5 ملليلتر من محلول stirifying و 200 ملليغرام من الكتلة الحيوية mycobacteria إلى أنبوب زجاجي محكم مع غطاء المسمار بطانة PTFE، وخلط محتويات عن طريق الدوامة.

احتضان الخليط داخل حمام جاف في 80 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، عندما يبرد الأنبوب درجة حرارة الغرفة، أضف ملليلترين من الهيكسان N، وخلط المحتويات لمدة 30 ثانية عن طريق الدوامة. السماح للأنبوب لتسوية حتى مرحلتين واضحة تظهر ونقل المرحلة العليا N hexane إلى أنبوب جديد.

اخلط ملليلترين إضافيين من N hexane مع محتويات الأنبوب واجمع الطبقة العليا مرة أخرى. ثم، تتبخر محتويات أنبوب عن طريق تدفق النيتروجين وتخزين العينة المغطاة بالنيتروجين في أربع درجات مئوية كما هو موضح. لتحليل العينات من قبل TLC تغطي جدار واحد من غرفة TLC مع قطعة من ورقة تصفية، إضافة الفازلين على زوايا الغرفة لختم الغرفة، يمكن للخليط المذيبات على ورقة تصفية وإضافة حجم المتبقية من المذيبات إلى الجزء السفلي من غرفة TLC.

أغلق غرفة TLC لمدة 20 دقيقة على الأقل إلى المشبعة. وفي الوقت نفسه، حل الدهون في الأنبوب الزجاجي في 200 إلى 1000 ميكرولتر من الكلوروفورم واستخدام أنبوب زجاجي شعري لتطبيق 10 ميكرولتر من تعليق الكلوروفورم الدهون مباشرة على لوحة TLC. بعد السماح للعينة بالجفاف لمدة خمس دقائق ، أدخل اللوحة في غرفة TLC المشبعة والسماح للمرحلة المتنقلة بالمرور عبر TLC.

عندما يصل المذيب إلى سنتيمتر واحد من الطرف العلوي من اللوحة ، ضع اللوحة تحت تدفق صفح حتى يجف السيليكا تماما. ثم رش اللوحة المجففة مع 15 إلى 20 ملليلتر من 10٪ من هيدرات حمض الفوسفوريك بيانات المولر في الإيثانول حتى لوحة صفراء زاهية، وتسخين لوحة لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق في 120 درجة مئوية. في هذا التحليل التمثيلي ، تم تحليل حمض الميكوليك المستخرج من مختلف أنواع البكتيريا الفطرية ، من خلال TLC أحادي الأبعاد باستخدام نظامين مختلفين وTLC ثنائي الأبعاد.

كما تم إجراء نوعين من إجراءات الميثيل لتأكيد وجود حمض الميكوليك من النوع الخامس. في كلا النظامين elution، كانت تقع الأحماض الميكوليك تقريبا في منتصف لوحة، على الرغم من أن، بقعة المقابلة لنوع حمض الميكوليك خمسة، لوحظ فقط بعد النسغ. TLC ثنائي الأبعاد يسمح أيضا تحديد أنواع حمض الميكوليك الفردية.

على سبيل المثال، الميكوباكتريا بروماي يعبر فقط نوع واحد الأحماض الميكوليك، mycobacterium bovis BCG يعبر عن النوع الأول والرابع، mycobacterium فورتيوم يعبر عن نوع واحد وخمسة، وabcessus mycobacterium يعبر عن نوع واحد واثنين من ملامح حمض الميكوليك. تم تحليل مقتطفات الدهون الإجمالية من مختلف أنواع البكتيريا الفطرية في وظيفة قطبيتها وحجمها. ويكشف أن معظم الدهون القطبية، مثل PDIMs، موجودة في البكتيريا الفطرية بوفيس BCG، ولكن ليس في الميكوباكتريا فورتويتوم، بروماي البكتيريا الفطرية ومورفوتيبي السلس من M abcessus.

الفينولية الجليكوليبيدات موجودة فقط في البكتيريا الفطرية بوفيس BCG، في حين لوحظ جليكوبيبتيدوليبيدس فقط في عينات من البكتيريا الفطرية abcessus. على غرار الأحماض الميكوليكية ، يمكن أيضا تصور Acylglycerols و PDIMs ، PIMs ، بسهولة من خلال تحليل TLC أحادي الأبعاد أو TLC ثنائي الأبعاد. تم استخدام نوعين من البقع للكشف عن PIMs في TLC أحادي الأبعاد.

أهم شيء يجب تذكره عند محاولة هذا البروتوكول هو عدم استخدام أي أدوات بلاستيكية طوال العملية.