استخراج جانجليوسيد وتنقيته وتوصيفه

يتم التعبير عن Gangliosides على جميع أسطح الخلايا الفقارية وهي وفيرة بشكل خاص على الخلايا العصبية. أنها تنظم إشارات الخلية والتعرف على الخلايا الخلوية. يقدم هذا البروتوكول عزل وتحليل العقديات.

تم اختيار التقنيات لزيادة غلة العقديات إلى أقصى حد على النطاقات الكبيرة والصغيرة مع تبسيط التنقية. كما نصف طرقا لإجراء تحليلات جانجليوسيد النوعية وشبه الكمية بسرعة نسبية. تتطلب الدراسة على الدهون ، وخاصة الدهون القطبية مثل العقديات ، أدوات وتقنيات مختلفة عن العمل مع البروتينات أو الأحماض النووية.

يعرفك هذا الفيديو على كيفية العمل مع هذه الجزيئات. نظرا لأن المذيبات مثل الكلوروفورم ورباعي هيدروفوران تذوب البلاستيك الشائع ، فإننا نستخدم زجاجات وقوارير ذات أغطية مبطنة بالتفلون ، وماصات زجاجية ، وزجاج ، ومحاقن دقيقة من الفولاذ المقاوم للصدأ ، ومجانسات زجاج تفلون طوال هذه الإجراءات. الفشل في القيام بذلك يؤدي إلى البوليمرات البلاستيكية في المنتجات التي يمكن أن تتداخل مع التحليلات.

للبدء ، أضف 4.1 ملليلتر من الماء لكل غرام من الوزن الرطب للأنسجة ، وقم بتجانسه ب 10 سكتات دماغية. أضف 13 ملليلتر من الميثانول لكل غرام من الأنسجة. انقله إلى درجة حرارة محيطة تبلغ 22 درجة مئوية ، واخلطه.

انقل الأنسجة إلى أنبوب سميك الجدران وزجاجي مغطى بالمسمار مع غطاء لولبي مبطن ب PTFE ، واخلطه جيدا. أضف 6.5 ملليلتر من الكلوروفورم لكل غرام من الأنسجة ، وقم بتغطيته ، واخلطه جيدا. جهاز طرد مركزي في 450 مرة غرام لمدة 15 دقيقة.

ثم انقل السوبرناتانت الشفاف إلى أنبوب جديد مغطى بالمسمار ، وقم بقياس الحجم كحجم مستخلص مسترد. للتقسيم ، أضف 0.173 مرة من حجم المستخلص المسترد من الماء إلى supernatant الواضح. ثم قم بتغطيته.

دوامة بقوة. جهاز طرد مركزي في 450 مرة غرام لمدة 15 دقيقة. انقل المرحلة العليا ، التي تحتوي على العقديات ، إلى أنبوب زجاجي جديد مع غطاء لولبي مبطن ب PTFE.

لإجراء كروماتوغرافيا خرطوشة الطور العكسي، استخدم حقنة زجاجية سعة خمسة ملليلتر لغسل خرطوشة استخراج الطور الصلب tC18 بثلاثة ملليلترات من الميثانول. ثم أضف ثلاثة ملليلترات من الكلوروفورم والميثانول والماء بنسبة اثنين إلى 43 إلى 55. قم بتحميل المرحلة العليا من الخطوة السابقة على خرطوشة tC18 من خلال نفس المحقنة الزجاجية.

اجمع التدفق وإعادة تحميله على العمود لتحسين الامتزاز. اغسل الخرطوشة بثلاثة ملليلترات من ماء الكلوروفورم والميثانول ثم بثلاثة ملليلترات من ماء الميثانول. قم بإخراج العقد مع ثلاثة ملليلتر من الميثانول في أنبوب جديد مغطى بالمسمار.

يتبخر حتى يجف تحت تيار لطيف من النيتروجين عند درجة حرارة أقل من أو تساوي 45 درجة مئوية. يذوب في الميثانول عند ملليلتر واحد لكل غرام من الوزن الرطب الأصلي للأنسجة. ضع 100 جرام من المادة الرمادية في الدماغ في الخلاط ، وأضف ملليلتر واحد لكل غرام من الوزن الرطب للدماغ من المخزن المؤقت المبرد و 10 ملليمولار من فوسفات البوتاسيوم من الرقم الهيدروجيني 6.8.

ثم تجانس على انخفاض لمدة 20 ثانية. أضف ثمانية ملليلترات من رباعي هيدروفوران لكل غرام من الوزن الرطب للدماغ ، وتجانس على مستوى منخفض لمدة 10 ثوان. صب في زجاجات الطرد المركزي الزجاجية ، وأجهزة الطرد المركزي في 5،000 مرات غرام لمدة 15 دقيقة.

جمع supernatant ، وقياس حجمه ، ثم نقله إلى قمع فاصل زجاجي. أضف 0.3 ملليلتر من إيثيل الأثير لكل ملليلتر من الأثير الفائق. رجه بقوة.

ثم اتركه يجلس دون إزعاج لمدة 30 دقيقة ، تنفصل خلالها مرحلتان ، مرحلة الأثير العلوي والمرحلة المائية السفلية. جمع المرحلة السفلى ، التي تحتوي على gangliosides ، في زجاجة زجاجية مع غطاء مبطن PTFE. إلى مرحلة الأثير العلوي المتبقية في القمع الفاصل ، أضف 0.1 ملليلتر من الماء لكل ملليلتر من supernatant الأصلي من الخطوة السابقة.

رجه بقوة. اسمح للمراحل بالفصل. ثم جمع المرحلة المائية السفلى ، ودمجها مع المرحلة السفلية التي تم جمعها سابقا.

تبخر المراحل السفلية مجتمعة إلى مسحوق جاف ، ووزنها. لإجراء كروماتوغرافيا الطور العكسي، اغسل مسبقا خرطوشة استخراج الطور الصلب tC18 واسعة النطاق عن طريق تمرير 50 ملليلتر من المذيبات عبر العمود باستخدام الفراغ أو الضغط لمدة تقل عن دقيقة واحدة لكل غسلة. قم بتحميل المرحلة العليا من فصل مرحلة ما بعد التصبن على العمود عن طريق الفراغ أو الضغط.

ثم قم بجمع التدفق وإعادة تحميله وجمع التدفق مرة أخرى للتحليل اللاحق. اغسل العمود ب 30 ملليلتر لكل من ماء الكلوروفورم والميثانول ، يليه ماء الميثانول. ثم قم بإخراج العقديات مع 50 ملليلتر من الميثانول ثم مرة أخرى مع 10 ملليلتر من الميثانول.

اجمع كل غسل وإزالة على حدة. استخدم كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة ، أو TLC ، للتأكد من أن العقديات غائبة عن التدفق وتغسل وتزول في أول عملية إزالة للميثانول. تبخر العقد المنتفخة إلى مسحوق جاف ، ووزنها.

لأداء TLC ، صب المذيب الجاري في غرفة TLC زجاجية 10 × 10 سم مع غطاء من الفولاذ المقاوم للصدأ بحيث يكون عمق المذيب 0.5 سم. قم بتغطية الغرفة ، واتركها تتوازن لمدة 10 دقائق. اغسل حقنة هاميلتون سعة 10 ميكرولتر بإبرة مشطوفة باستخدام الميثانول.

اسحب ميكرولتر واحد من الميثانول في حقنة زجاجية لملء الحجم الميت للإبرة ثم ميكرولتر واحد من العينة أو المعيار. حدد العينة بالتساوي على الخطوط المحددة مسبقا والتي يبلغ طولها خمسة ملليمترات حتى يبقى أقل من ميكرولتر واحد من مذيب الميثانول في المحقنة. اترك الصفيحة لتجف عند 22 درجة مئوية بعد رصد جميع العينات.

ضع اللوحة المرقطة والمجففة على غرفة TLC المتوازنة مسبقا مع غمر الحافة السفلية في المذيب الجاري. اسمح للمذيب الجاري بالتقدم إلى أعلى اللوحة عن طريق العمل الشعري حتى تصل جبهة المذيب إلى مسافة سنتيمتر واحد من الجزء العلوي من اللوحة. قم بإزالة ووضع علامة على مقدمة المذيب على حافة اللوحة بقلم رصاص.

اسمح للمذيبات بالتبخر تماما إما دون إزعاج أو تحت تدفق هواء معتدل. في غطاء الدخان الكيميائي ، ضع لوحة TLC مع أصل العقد التي تم حلها رأسا على عقب في صندوق من الورق المقوى المقطوع لحماية جدران الغطاء من رذاذ الحمض. ضع كاشف رذاذ ريسورسينول في بخاخ TLC زجاجي.

قم بإرفاقه بمصدر للنيتروجين المضغوط ، ورش اللوحة برفق قطريا في الاتجاهين الرأسي والأفقي. قم بتغطية اللوحة على الفور بلوحة غطاء زجاجية نظيفة وجافة من نفس الأبعاد ، وقم بتثبيت لوحة الغطاء في مكانها باستخدام مشابك الموثق. سخني الطبق المغطى على حرارة 125 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.

ستظهر Gangliosides باللون الأرجواني الداكن على خلفية بيضاء. لإجراء تلطيخ الدهون ، اغمس لوحة TLC مع أصل العقد المحلولة جانبا في كوب يحتوي على بقعة أنيسالدهيد. انغمس في مقدمة الجري لأكثر من ثانيتين بقليل.

ثم اتركه يستنزف. قم بتسخين لوحة TLC على صفيحة ساخنة عند درجة حرارة منخفضة لتطويرها. يوفر هذا البروتوكول العقديات بكمية ونقاء كافيين لتحديد نوعي وكمي.

توفر دقة TLC لميكرولتر واحد مادة وافرة للكشف عن الريسورسينول وتحل جميع العقد الدماغية الرئيسية للفئران من النوع البري والمعدلة وراثيا. على الرغم من أن العقديات المختلطة المحضرة ليست خالية من الدهون الرئيسية الأخرى ، إلا أنها ذات نقاء كاف لتحديد الطيف الكتلي إما كجانجليوسيدات أصلية منقية في الوضع السلبي أو بعد المثيلة المسبقة في الوضع الإيجابي. يشمل التنقية على نطاق واسع الاستخراج والتصبن ودقة HPLC لتوفير العقد الدماغية الرئيسية النقية المناسبة للتجارب البيولوجية ولمزيد من التعديلات الكيميائية والإنزيمية.

يتم عرض ملف تعريف HPLC مثالي وتحليل TLC اللاحق. العلاج القلوي ، أو التصبن ، ضروري لتحلل وإزالة الدهون الفوسفاتية الملوثة ، ولكنه سيؤدي أيضا إلى تحلل التعديلات الطبيعية للجانجليوسيدات مثل أحماض السياليك O-acetylated ، والتي قد تكون مهمة في بعض السياقات. تعد نسب المذيبات الدقيقة للاستخراج وتقسيم المذيبات ودقة TLC أمرا بالغ الأهمية لتعزيز الاسترداد والنقاء والتحليلات.

من السرطان إلى التمثيل الغذائي إلى وظائف الدماغ ، فإن العقد هي معدلات فسيولوجية وأهداف علاجية. يعد عزل Ganglioside وتنقيته وتحليلاته حجر الزاوية في اكتشاف الطب الحيوي والتطوير العلاجي.