تشريح الخصائص الميكانيكية الأنزيمية للميوسينات العملية باستخدام التحليل الطيفي فائق السرعة لقوة المشبك

التحليل الطيفي فائق السرعة بمشبك القوة هو تقنية جزيء واحد تعتمد على ملاقط الليزر التي تجعل من الممكن التحقيق في الميكانيكا الكيميائية لمحركات الميوسين تحت الحمل بأعلى دقة زمنية. تسمح هذه التقنية بفحص الأحداث السريعة جدا في إنتاج القوة من خلال الحفاظ على ثبات القوة خلال كل مرحلة من مراحل التفاعل الحركي مع التحكم الكامل في اتجاه القوة. من خلال إجراء التعديلات المناسبة ، يمكن تطبيق هذا البروتوكول بسهولة على أنواع أخرى من المحركات المعالجة ، بما في ذلك kinesins و dyneins ، للكشف عن التنظيم بالقوة.

بعد تركيب مجموعة واحدة من العاكسات الصوتية البصرية على مترجم خطي ، خذ قزحية واضبط فتحتها لتناسب حجم الفتحة الخلفية المستهدفة. استبدل الهدف بالقزحية المتمركزة على السكن الموضوعي الملولب. حرك المترجم باتجاه شعاع الليزر حتى يصبح جزء الحزمة المسدود بواسطة بلورة بيزو مرئيا بعد القزحية ، وأدر المترجم للخلف قليلا حتى يملأ الشعاع فتحة القزحية تماما.

لإعداد حبات السيليكا في خلات بنتيل ، تمييع أولا 20 ميكرولتر من حبات السيليكا الصلبة 1.2 ميكرون 10 ٪ في 1-1.5 ملليلتر من الأسيتون مع دوامة و 30 ثانية من صوتنة. بعد صوتنة ، اجمع الخرز عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق حبيبات الخرزة في 1 ملليلتر من الأسيتون الطازج لغسل ثان. بعد غسل الأسيتون الثاني ، اغسل الخرز ثلاث مرات في 1 ملليلتر من أسيتات البنتيل الطازجة لكل غسلة في ظل نفس ظروف الطرد المركزي ، وأعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من 1٪ من النيتروسليلوز و 900 ميكرولتر من أسيتات البنتيل.

بعد ذلك ، استخدم قطعة نقية مبللة بالإيثانول من أنسجة المختبر لمسح غطاء زجاجي مقاس 24 × 24 ملم بعناية قبل استخدام ملاقط نظيفة لشطف الزجاج مباشرة في الإيثانول والسماح لغطاء الغطاء بالجفاف تحت تدفق النيتروجين اللطيف. دوامة وصوتيك مخزون حبة السيليكا المحضرة لمدة 30 ثانية واستخدم غطاء 24 × 60 ملم منظف بالإيثانول لتشويه 2 ميكرولتر من محلول حبة السيليكا على سطح غطاء أصغر. أثناء تجفيف الخرز ، قم بتنظيف شريحة مقاس 26 × 76 ملم كما هو موضح ، وضع خطين بسمك 60-100 ميكرون من 3 ملم على الوجهين مسجلين على الحواف الطويلة للشريحة.

باستخدام ملاقط نظيفة ، ضع الغطاء المطلي بالخرز على الشريط بحيث تواجه الخرز داخل حجرة الشريحة ، واملأ الحجرة بمحلول فوسفات 15 مليمولار ومحلول حبة البوليسترين العائم. ثم أغلق الغرفة بشحم السيليكون. لمعايرة نسبة البكسل إلى النانومتر لكاميرا برايت فيلد ، احصل على صورة أولى لحبة السيليكا على سطح الغطاء على بعد حوالي 5 ميكرون من مركز مجال الرؤية.

حرك المسرح لإزاحة الخرزة 10 ميكرون باتجاه مركز مجال الرؤية والتقط صورة ثانية. احسب ثابت معايرة الكاميرا عن طريق قياس مسافة البكسل بين موضعين للخرزة. لمعايرة موضع المصيدة ، قم بحبس جسيم عائم واحد في مصيدة واحدة وحرك العاكسات الصوتية البصرية في خطوات 0.2 ميغا هرتز ، والحصول على صورة للجسيم والتردد المقابل للعاكسات لكل خطوة.

ثم كرر معايرة المصيدة الثانية بنفس الطريقة. لمعايرة قوة المصيدة وصلابتها ، قم بحبس جسيم واحد في كل مصيدة وإزاحة كلا المصيدتين باستخدام العاكسات الصوتية البصرية في خطوات 0.2 ميغا هرتز ، مع تسجيل حركة براونية للجسيم في كلا المصيدتين باستخدام كاشفات الثنائي الضوئي الرباعية والتردد المقابل للعاكسات الصوتية البصرية. احصل على ثوابت المعايرة عن طريق تركيب دالة لورنتزيان على طيف طاقة للحركة البراونية المسجلة.

لتجميع عينة للقياس ، أضف 1 ملليغرام لكل ملليلتر من BSA البيوتينيل إلى غرفة جديدة بها حبات السيليكا على سطح الغطاء. بعد 5 دقائق ، اغسل الغرفة باستخدام AB buffer وأضف 1 ملليغرام لكل ملليلتر من الستربتافيدين إلى الغرفة. بعد 5 دقائق ، اغسل الحجرة كما هو موضح ، وأضف 3 بيوتينيل نانومولار بيوتينيل ميوسين-5B ثقيل ميروميوسين في مخزن M5B مكمل ب 2 ميكرومولار كالمودولين.

بعد 5 دقائق ، اغسل الحجرة ثلاث مرات ب 1 ملليغرام لكل ملليلتر من BSA البيوتينيل المكمل ب 2 ميكرومولار كالمودولين في AB buffer وانتظر 3 دقائق بعد الغسيل النهائي. تدفق خليط التفاعل وختم الغرفة مع الشحوم السيليكون. لقياس العينة ، ضع الحجرة على مرحلة المجهر وحرك الهدف حتى يتم التركيز على حبات ألفا أكتينين العائمة.

قم بتشغيل فخ واحد وفخ حبة واحدة. بمجرد شغل المصيدة الأولى ، حرك المترجم لوضع الخرزة المحاصرة بالقرب من سطح الغطاء لتجنب محاصرة حبات متعددة ، وحبس حبة في المصيدة الثانية. قم بإزاحة العينة من خلال المترجمين بعيدي المدى لتحديد خيوط الأكتين التي لا يقل طولها عن 5 ميكرون داخل المحلول.

عند رصد خيط ، حرك العينة للسماح لحبة محاصرة بالاقتراب من أحد طرفي الفتيل. بمجرد توصيل الفتيل ، اضبط مسافة الخرزة على طول الفتيل التقريبي وحرك المرحلة لإنشاء تدفق في اتجاه الخرزة غير المرتبطة. سوف يتمدد الفتيل بفعل التدفق ويرتبط في النهاية بالخرزة الثانية.

يسمى المجمع الناتج الدمبل"لإنشاء اتصال الأكتين والميوسين ، افصل الفخين برفق واضبط الفتيل على مستويات التظاهر حتى حوالي 3 بيكونوتون. للتحقق من صلابة الدمبل ، اجعل مصيدة واحدة تتأرجح في موجة مثلثة عن طريق تغيير تردد عاكس صوتي بصري واحد والتحقق من انتقال الحركة إلى الخرزة الخلفية من خلال إشارة موضعها. حرك المسرح لوضع الدمبل بالقرب من حبة السيليكا ذات القاعدة واضبط ارتفاع الدمبل بحيث يتلامس خيوط الأكتين مع سطح حبة السيليكا.

كما لوحظ في سجل الموضع التمثيلي هذا، عندما لا يتفاعل محرك الميوسين مع خيط الأكتين، تتحرك الحبيبات المحبوسة بسرعة ثابتة عكس قوة السحب اللزجة للمحلول. بمجرد أن يبدأ محرك الميوسين في التفاعل مع الفتيلة، تنتقل القوة التي تحملها الخيوط المتحركة بسرعة كبيرة إلى البروتين، وتنخفض سرعة النظام إلى الصفر، مع حدوث أحداث التدرج تحت تأثير ثابت حتى نهاية المدى. يتم تبديل القوة من الاتجاه الإيجابي إلى الاتجاه السلبي بواسطة نظام التغذية المرتدة ، والذي يغير اتجاه القوة عندما تصل الخرزة إلى حافة نطاق التذبذب الذي حدده المستخدم.

عندما يرتبط الميوسين بخيط الخيط ويزيحه في اتجاه الاتجاه الموجب، فإنه يدفع الخرزة نحو الحافة العلوية لنطاق الاهتزاز. إذا حدث هذا تحت تأثير القوة المساعدة، فسيتوقف مسار الميوسين بسبب انعكاس اتجاه القوة عند حافة الاهتزاز، مما يحد من طول المدى إلى سعة تذبذب الدمبل. تعد المحاذاة الدقيقة للنظام البصري ضرورية لتحقيق الدقة المكانية والزمانية المثلى ، في حين أن المعايرة الدقيقة ضرورية لتحديد قيم القوى المطبقة بدقة.

تم تكييف هذه التقنية لدراسة البحث المنزلق والمستهدف لعوامل النسخ في الحمض النووي بالإضافة إلى التفاعلات الديناميكية بين بروتينات النقل الميكانيكي التي يتم تحريضها على خيوط الأنابيب الدقيقة.