Name: 15 N CPMG التشتت الاسترخاء للتحقيق في ديناميات تشكيل البروتين على مقياس زمني μs-ms (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: تعلم استخدام تقنية تشتت الاسترخاء CPMG لتحليل ديناميات تشكيل البروتين بدقة ذرية على مقياس زمني μs-ms. هذه الطريقة تُمكّن من دراسة الحركية والديناميكا الحرارية للتفاعلات البيولوجية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وقد تم دعم هذا العمل بأموال من NIGMS R35GM133488 ومن صندوق روي ج. كارفر الخيري إلى V.V.

1. إعداد عينة NMR
<ol><li>التعبير عن وتنقية 2H،15N-labled عينة من البروتين من الفائدة. ملاحظة: في حين يمكن استخدام عينة بروتين 15N المسمى للحصول على تجربة CPMG RD، perdeuteration (حيثما أمكن) يزيد بشكل كبير من جودة البيانات التي تم الحصول عليها. بروتوكولات لإنتاج البروتينات perdeuterated متوفرة في الأدب13.</li>
	<li>المخزن المؤقت تبادل عينة البروتين المنقى في مخزن مؤقت NMR degassed.</li>
	<li>نقل عينة NMR إلى أنبوب NMR. ملاحظة: يجب تحسين تركيز عينة NMR بعناية من أجل زيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء وتقليل حدوث التفاعلات بين البروتين والبروتين. بشكل عام، يتراوح نطاق التركيز النموذجي لتجارب CPMG بين 0.1 و1.0 مللي متر.</li>
</ol>2. أول مرة إعداد تجربة NMR
<ol><li>تحميل وفك الملفات التكميلية.</li>
	<li>نسخ bits.vv الملفات و trosy_15N_cpmg.vv (الموجود في المجلد المسمى برنامج نبض) في دليل برنامج النبض (&lt;باث&gt;/إكسب/ستان/nmr/lists/pp/user). ملاحظة: تأكد من المسار إلى bits.vv المسرودة في السطر الأول من الملف trosy_15N_cpmg.vv الصحيح.</li>
	<li>فتح برنامج الاستحواذ ونسخ تجربة HSQC 1H-15N تشغيل سابقا في تجربة جديدة باستخدام الأمر edc.</li>
	<li>باستخدام pulprogالأمر ، تحميل برنامج نبض trosy_15N_cpmg.vv في التجربة التي تم إنشاؤها حديثا.</li>
	<li>إعداد تجربة CPMG باستخدام التعليمات المتوفرة في نهاية ملف برنامج النبض (trosy_15N_cpmg.vv).</li>
</ol>3. الإعداد الروتيني لتجربة NMR
<ol><li>إدخال العينة في المغناطيس وتنفيذ جميع الخطوات الأساسية للحصول على أي تجربة NMR: قفل وshim العينة؛ تطابق وضبط 1H و 15N القنوات.</li>
	<li>تعيين p1 و p7 لمدة 1H و 15N الثابت 90° البقول, على التوالي. ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، من المهم معايرة نبض 15N 90 درجة بعناية فائقة. عادة ما يتم إنجاز المعايرة باستخدام عينة 100 mM من 15ن المسمى اليوريا في DMSO كما هو موضح في دليل المطياف. بالإضافة إلى ذلك، من الممكن التحقق من المعايرة مباشرة على عينة NMR العاملة عن طريق الحصولعلى الزيادة الأولى من طيفH-15N HSQC الذي يتم فيه تحويل نبض 15N 90° من الكتلة INEPT الأولى إلى نبض 180 درجة. إذا كانت المعايرة صحيحة، يجب الحصول على قيمة خالية.</li>
	<li>في نافذة الامتلاك، قم بتعيين العرض الوسطي الطيفي لأبعاد 1H و 15N. ملاحظة: مركز الطيف 1H في وتيرة إشارة المياه لقمع المياه الأمثل.</li>
	<li>تعيين تأخير الاسترخاء (d30) يساوي 0.7 T2, حيث T2 هو المتوقع 15N وقت الاسترخاء العرضي للبروتين الخاص بك. ملاحظة: يمكن تحسين قيمة d30 تجريبيا للحصول على أفضل النتائج.</li>
	<li>استخدم vclist الأمر لإنشاء قائمة أرقام عدد صحيح المطابقة إلى المعلمة n في الشكل 1A والشكل 1B. تأكد من أن كل إدخال في القائمة يتوافق مع حقل CPMG مختلف (νcpmg) وفقا ل νcpmg = 4 × n / d30. تأكد من أن الرقم الأول في القائمة هو 0 (وهذا يتوافق مع التجربة المرجعية التي يتم تخطي كتلة CPMG وd30 = 0 s) وعدم استخدام أرقام أكبر من 1000 × d30 / 4. أرقام أكبر من هذه العتبة يؤدي إلى νcpmg &gt; كيلوهرتز 1 وقد تلحق الضرر التحقيق.</li>
	<li>تعيين l8 إلى عدد الإدخالات في vclist، l3 إلى عدد من النقاط الحقيقية للبعد غير المباشر (عادة ما يتم تعيين نطاق من 64-200 ل L3)، و 1 td يساوي l8 × l3 × 2. ملاحظة: تنفيذ الخطوات 3.7-3.11 لتحسين منع المياه.</li>
	<li>تعيين كسب المتلقي (rg) إلى 1; فتح ملف برنامج نبض (edcpul) ، انتقل إلى السطر 91 ، وإزالة الفاصلة المنقوطة السابقة goto 999، وحفظ الملف.</li>
	<li>باستخدام الأمر gs ضبط المعلمات spdb0 (أو spdw0) من أجل تقليل كثافة إشارة FID.</li>
	<li>إعادة إدخال الفاصلة المنقوطة في السطر 91 من ملف برنامج النبض وحفظ الملف.</li>
	<li>كرر الخطوات 3.7-3.9 لتحسين spdb11 (سطر 168 من ملف برنامج النبض) ، spdb2 (سطر 179 من ملف برنامج النبض) ، وpldb2 (سطر 184 من ملف برنامج النبض).</li>
	<li>تشغيل rga الأمر لتحسين كسب المتلقي.</li>
	<li>تعيين عدد عمليات المسح(ns)إلى مضاعف 8.</li>
	<li>تشغيل الأمر zg لبدء التجربة.</li>
</ol>4. معالجة وتحليل بيانات NMR
<ol><li>نسخ المجلد المسمى عملية (ملفات تكميلية) في الدليل الذي يحتوي على ملف ser.</li>
	<li>استخدم الملفات sep_fid.com ft2D.com لمعالجة بيانات NMR. ملاحظة: يتم توفير إرشادات حول كيفية تحرير البرامج النصية المعالجة ضمن sep_fid.com وملفات ft2D.com.</li>
	<li>افتح الملفات ucsf المضمنة في الدليل CPMG_Sparky_files في Sparky. ملاحظة: يتم إنشاء ملفات ucsf بواسطة البرامج النصية المعالجة. هناك ملف ucsf واحد لكل إدخال في vclist. يحتوي الملف الأول ucsf (test_1.ucsf) على التجربة المرجعية. ملفات ucsf اللاحقة (test_2.ucsf، test_3.ucsf,... test_n.ucsf) يتم ترتيبها من أدنى إلى أكبر قيمة من νcpmg.</li>
	<li>اختر قمم عبور NMR على طيف NMR المرجعي (test_1.ucsf).</li>
	<li>حدد جميع القمم المتقاطعة التي تم انتقاؤها باستخدام الأمر Sparky pa.</li>
	<li>تشغيل الأمر سباركي rh. يفتح هذا الأمر إطار حوار. حدد ارتفاعات الخيار في نفس الموضع في كل طيف. انقر على الإعداد والتحقق من جميع الأطياف NMR. انقر على تحديث وحفظ ملف الإخراج في دليل العمل. يحتوي ملف الإخراج على مصفوفة شدة الإشارة على جميع أطياف NMR المفتوحة. ملاحظة: وقد وصفت بروتوكولات أكثر دقة التي تستخدم خط شكل المناسب لاستعادة كثافة من التجارب الزائفة 3D متشابكة في الأدب14. تتوفر برامج متاحة مجانا لتركيب خط الخطوط في https://pint-nmr.github.io/PINT/ (PINT) https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/fuda/ (FUDA) وداخل NMRPipe (وحدة nLinLS) و SPARKY (وحدة تكنولوجيا المعلومات).</li>
	<li>لكل حقل CPMG، تحويل كثافة إشارة إلى معدلات R2 باستخدام <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq03.jpg"> الصيغة، حيث أنا0 وأنا d30 هي كثافة المرجع (vc = 0) واسترخاء (vc &gt; 0) أطياف NMR، على التوالي. ملاحظة: في الملفات التكميلية، يتم توفير قالب ملف جدول البيانات (R2_calc.xls) المستخدمة لتحويل كثافة الإشارة إلى معدلات R2 وتصور ملفات تعريف RD.</li>
	<li>قراءة مستوى الضوضاء في الطيف المرجعي باستخدام St الأمر سباركي ونشر الخطأ على معدلات R2. ملاحظة: في الملفات التكميلية، يتم توفير قالب ملف جدول البيانات (R2_calc.xls) المستخدمة لنشر الخطأ على معدلات R2 المقاسة.</li>
</ol>5. تركيب منحنيات RD
<ol><li>نسخ المجلد المسمى RD_fitting(ملفات تكميلية)في دليل العمل.</li>
	<li>لكل ذروة NMR المعينة، تقدير Rالسابقين عن طريق حساب <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq04.jpg"> . <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq05.jpg"> <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq06.jpg"> 
</li>
	<li>بصريا فحص منحنيات RD مع Rالسابقين أكبر من مرتين الخطأ المقدر وتجاهل جميع منحنيات RD التي هي صاخبة جدا لتكون على غرار بدقة. ملاحظة: يمكن نشر الضوضاء على Rex من الأخطاء على <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq05.jpg"> و <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq06.jpg"> .</li>
	<li>قم بإعداد ملف إدخال للبرنامج النصي المناسب باستخدام كافة منحنيات RD مع Rex أكبر من مرتين الخطأ المقدر. ملاحظة: يتم توفير إرشادات مفصلة حول إعداد ملفات الإدخال ضمن البرامج النصية المناسب. يتم توفير ملفات الإدخال المثال كملفات تكميلية. عادة، يتم قياس بيانات RD في حقلين ثابتين مختلفين وتركيبها في وقت واحد. في هذا البروتوكول، مطلوب ملفين إدخال مختلفين(ملفات تكميلية).</li>
	<li>احتواء بيانات RD باستخدام البرامج النصية المتوفرة في ملفات تكميلية. ملاحظة: يتم توفير برنامجين نصيين مختلفين لتنفيذ نوبة عمومية من منحنيات RD المستندة إلى المخلفات أو على التوالي. كلا البرنامجين النصيين تناسب منحنيات RD باستخدام نموذج تبادل موقعين ومعادلة كارفر ريتشاردز. يتم توفير تعليمات أكثر تفصيلا ضمن البرامج النصية المناسب. حزم برامج إضافية مثل Chemex (https://github.com/gbouvignies/ChemEx) وCATIA (https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/catia/) متاحة لتنفيذ البيانات المناسبة باستخدام معادلات بلوك ماكونيل.</li>
	<li>اختبار موثوقية المعلمات المجهزة تقدير انخفاض خي2 كدالة فب وكالسابقين. ملاحظة: يتم توفير خي 2 مخفضة في ملف الإخراج. فب و كالسابقين يمكن تقييدها لقيم محددة باستخدام الحدود الدنيا والعليا في إجراءات المناسب. في نصوصنا، الحدود الدنيا والعليا لpb هي lb(2) وub(2)، على التوالي. الحدود السفلى والعليا ل كالسابقين هي lb(3) وub(3) ، على التوالي.</li>
	<li>تقدير الخطأ في المعلمات المجهزة. يمكن القيام بذلك عن طريق تعيين قيمة MC_fac في البرنامج النصي إلى 1 وتكرار المناسب عدة مرات (عادة &gt;20 يكرر). يتم تقدير الخطأ في كل معلمة على أنه الانحراف المعياري للتوزيع. ملاحظة: إعداد MC_fac إلى 1 يولد مجموعة بيانات اصطناعية يتم فيها إضافة خطأ موزع غاوسي (محسوب استنادا إلى الخطأ التجريبي) إلى البيانات التجريبية.</li>
</ol>

<ol><li>Anthis, N. J., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+transient+dark+states+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).</li>
<li>Lisi, G. P., Loria, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+NMR+spectroscopy+for+the+study+of+enzyme+allostery%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery.</a> Chemical Reviews. 116 (11), 6323-6369 (2016).</li>
<li>Mittermaier, A., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+provide+new+insights+in+NMR+studies+of+protein+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics.</a> Science. 312 (5771), 224-228 (2006).</li>
<li>Venditti, V., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+selection+and+substrate+binding+regulate+the+monomer%2Fdimer+equilibrium+of+the+C-terminal+domain+of+Escherichia+coli+enzyme+I%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Conformational selection and substrate binding regulate the monomer/dimer equilibrium of the C-terminal domain of Escherichia coli enzyme I.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26989-26998 (2012).</li>
<li>Venditti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+interdomain+rearrangement+triggered+by+suppression+of+micro-+to+millisecond+dynamics+in+bacterial+Enzyme+I%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Large interdomain rearrangement triggered by suppression of micro- to millisecond dynamics in bacterial Enzyme I.</a> Nature Communications. 6, 5960(2015).</li>
<li>Yip, G. N., Zuiderweg, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+cycle+scheme+that+significantly+suppresses+offset-dependent+artifacts+in+the+R2-CPMG+15N+relaxation+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">A phase cycle scheme that significantly suppresses offset-dependent artifacts in the R2-CPMG 15N relaxation experiment.</a> Journal of Magnetic Resonance. 171 (1), 25-36 (2004).</li>
<li>Mulder, F. A., Skrynnikov, N. R., Hon, B., Dahlquist, F. W., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+slow+%28micros-ms%29+time+scale+dynamics+in+protein+side+chains+by+%2815%29N+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy%3A+application+to+Asn+and+Gln+residues+in+a+cavity+mutant+of+T4+lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Measurement of slow (micros-ms) time scale dynamics in protein side chains by (15)N relaxation dispersion NMR spectroscopy: application to Asn and Gln residues in a cavity mutant of T4 lysozyme.</a> Journal of the American Chemical Society. 123 (5), 967-975 (2001).</li>
<li>Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TROSY+CPMG+sequence+for+characterizing+chemical+exchange+in+large+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+NMR%22%5BJournal%5D)">A TROSY CPMG sequence for characterizing chemical exchange in large proteins.</a> Journal of Biomolecular NMR. 15 (2), 151-155 (1999).</li>
<li>Dotas, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+thermophilic%2Fmesophilic+enzymes+reveal+a+role+for+conformational+disorder+in+regulation+of+bacterial+Enzyme+I%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hybrid thermophilic/mesophilic enzymes reveal a role for conformational disorder in regulation of bacterial Enzyme I.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (16), 4481-4498 (2020).</li>
<li>Purslow, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+site+breathing+of+human+Alkbh5+revealed+by+solution+NMR+and+accelerated+molecular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Active site breathing of human Alkbh5 revealed by solution NMR and accelerated molecular dynamics.</a> Biophysical Journal. 115, 1895-1905 (2018).</li>
<li>Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+relaxation-compensated+Carr%E2%88%92Purcell%E2%88%92Meiboom%E2%88%92Gill+sequence+for+characterizing+chemical+exchange+by+NMR+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A relaxation-compensated Carr−Purcell−Meiboom−Gill sequence for characterizing chemical exchange by NMR Spectroscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 121 (10), 2331-2332 (1999).</li>
<li>Hansen, D. F., Vallurupalli, P., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+15N+relaxation+dispersion+experiment+for+the+measurement+of+millisecond+time-scale+dynamics+in+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">An improved 15N relaxation dispersion experiment for the measurement of millisecond time-scale dynamics in proteins.</a> Journal of Physical Chemistry B. 112 (19), 5898-5904 (2008).</li>
<li>Tugarinov, V., Kanelis, V., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotope+labeling+strategies+for+the+study+of+high-molecular-weight+proteins+by+solution+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isotope labeling strategies for the study of high-molecular-weight proteins by solution NMR spectroscopy.</a> Nature Protocols. 1 (2), 749-754 (2006).</li>
<li>Niklasson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+NMR+data+using+advanced+line+shape+fitting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+NMR%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of NMR data using advanced line shape fitting.</a> Journal of Biomolecular NMR. 69, 93-99 (2017).</li>
<li>Palmer, A. G. 3rd, Kroenke, C. D., Loria, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+magnetic+resonance+methods+for+quantifying+microsecond-to-millisecond+motions+in+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Nuclear magnetic resonance methods for quantifying microsecond-to-millisecond motions in biological macromolecules.</a> Methods in Enzymology. 339, 204-238 (2001).</li>
<li>Tollinger, M., Skrynnikov, N. R., Mulder, F. A., Forman-Kay, J. D., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+dynamics+in+folded+and+unfolded+states+of+an+SH3+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Slow dynamics in folded and unfolded states of an SH3 domain.</a> Journal of the American Chemical Society. 123, 11341-11352 (2001).</li>
<li>Carver, J. P., Richards, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+two-site+solution+for+the+chemical+exchange+produced+dependence+of+T2+upon+the+Carr-Purcell+pulse+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">A general two-site solution for the chemical exchange produced dependence of T2 upon the Carr-Purcell pulse separation.</a> Journal of Magnetic Resonance. 6 (1), 89-105 (1972).</li>
<li>Egner, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+Contrast%27+NMR+Reveals+Non-innocent+Role+of+Support+in+Pd%2FCeO2+Catalyzed+Phenol+Hydrogenation%5BTitle%5D)+AND+%22ChemCatChem%22%5BJournal%5D)">Surface Contrast' NMR Reveals Non-innocent Role of Support in Pd/CeO2 Catalyzed Phenol Hydrogenation.</a> ChemCatChem. 12 (6), 4160-4166 (2020).</li>
<li>Egner, T. K., Naik, P., Nelson, N. C., Slowing, I. I., Venditti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+Insight+into+Nanoparticle+Surface+Adsorption+by+Solution+NMR+Spectroscopy+in+an+Aqueous+Gel%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+Edition+in+English%29%22%5BJournal%5D)">Mechanistic Insight into Nanoparticle Surface Adsorption by Solution NMR Spectroscopy in an Aqueous Gel.</a> Angewandte Chemie (International Edition in English). 56, 9802-9806 (2017).</li>
<li>Tugarinov, V., Libich, D. S., Meyer, V., Roche, J., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+energetics+of+a+three-state+protein+folding+system+probed+by+high-pressure+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+Edition+in+English%29%22%5BJournal%5D)">The energetics of a three-state protein folding system probed by high-pressure relaxation dispersion NMR spectroscopy.</a> Angewandte Chemie (International Edition in English). 54, 11157-11161 (2015).</li>
<li>Korzhnev, D. M., Kloiber, K., Kanelis, V., Tugarinov, V., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+slow+dynamics+in+high+molecular+weight+proteins+by+methyl-TROSY+NMR+spectroscopy%3A+application+to+a+723-residue+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Probing slow dynamics in high molecular weight proteins by methyl-TROSY NMR spectroscopy: application to a 723-residue enzyme.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3964-3973 (2004).</li>
<li>Mayzel, M., Ahlner, A., Lundstrom, P., Orekhov, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+backbone+%2813%29CO+and+%2815%29N+relaxation+dispersion+at+high+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+NMR%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein backbone (13)CO and (15)N relaxation dispersion at high resolution.</a> Journal of Biomolecular NMR. 69, 1-12 (2017).</li>
<li>Pritchard, R. B., Hansen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterising+side+chains+in+large+proteins+by+protonless+%2813%29C-detected+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Characterising side chains in large proteins by protonless (13)C-detected NMR spectroscopy.</a> Nature Communications. 10, 1747(2019).</li>
</ol>

وقد قرأ جميع المؤلفين المخطوطة ووافقوا عليها. نحن لا نعلن عن أي تضارب في المصالح.

تصف هذه المخطوطة البروتوكول المنفذ في المختبر للحصول على 15N RD من البيانات المتعلقة بالبروتينات وتحليلها. وعلى وجه الخصوص، يتم تغطية الخطوات الحاسمة لإعداد عينة NMR، وقياس بيانات NMR، وتحليل ملامح RD. وفيما يلي بعض الجوانب الهامة المتعلقة باقتناء وتحليل تجارب RD. ومع ذلك ، للحصول على وصف أكثر تعمقا للتجربة وتحليل البيانات ، يوصى بشدة بالدراسة الدقيقة للأدب الأصلي3و8و11و15و</sup...

كار بورسيل ميبوم جيل (CPMG) يتم استخدام تجارب تشتت الاسترخاء (RD) على قاعدة روتينية لتوصيف التوازنات التوافقية التي تحدث على مقياس الوقت μs-ms عن طريق التحليل الطيفي NMR الحل1،2،3،4،5. بالمقارنة مع الطرق الأخرى للتحقيق في الديناميات التوافقية ، فإن تقنيات CPMG سهلة التنفيذ نسبيا على مطياف NMR الحديث ، ولا تتطلب خطوات إعداد عينات متخصصة (أي التبلور أو تجميد العينة أو المحاذاة ، و / أو اقتران التكافؤ مع علامة فلورية أو مغناطيسية) ، وتوفر وصفا شاملا للتوازنات التركيبية العائدة للمعلومات الهيكلية والحركية والدينامية الحرارية حول عمليات التبادل. ولكي تقدم تجربة CPMG تقريرا عن التوازن التوافقي، يجب تطبيق شرطين: '1' يجب أن تكون للدورات المعدلة بالرنين المغناطيسي الملاحظة تحولات كيميائية مختلفة في الولايات التي تخضع لتبادل تشكيلي (حالات صغرى) و'2' يجب أن يحدث التبادل في مقياس زمني يتراوح بين ~ 50 ميكروس إلى ~ 10 مللي ثانية. في ظل هذه الظروف، ومعدل الاسترخاء العرضي الملاحظ <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq01v2.jpg"> () هو مجموع R2 الجوهرية (R2 تقاس في غياب ديناميات ميكروس مللي ثانية، <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq02v3.jpg"> ) ومساهمة الصرف إلى الاسترخاء العرضي (Rex). يمكن إخمادمساهمة R ex إلى R2obs تدريجيا عن طريق تقليل التباعد بين النبضات 180 درجة التي تشكل كتلة CPMG من تسلسل النبض ، ويمكن تصميم منحنيات RD الناتجة باستخدام نظرية Bloch-McConnell للحصول على الفرق في التحول الكيميائي بين الدول الصغيرة ، والسكان الكسور في كل ولاية صغيرة ، ومعدلات التبادل بين الدول الصغيرة (الشكل 1)1،2،3.
وقد تم الإبلاغ عن عدة تسلسلات نبض مختلفة وبروتوكولات التحليل في الأدبيات ل15تجارب N CPMG. هنا، يتم وصف البروتوكول المنفذ في المختبر. وعلى وجه الخصوص، سيتم إدخال الخطوات الحاسمة لإعداد عينة NMR، وإعداد واكتساب تجارب NMR، ومعالجة وتحليل بيانات NMR(الشكل 2). لتسهيل نقل البروتوكول إلى مختبرات أخرى، يتم توفير برنامج النبض، ومخطوطات المعالجة والتحليل، وإحدى مجموعات البيانات على سبيل المثال كملفات تكميلية وهي متاحة للتنزيل في (https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html). يتضمن تسلسل النبض المقدم دورة مرحلية من أربع خطوات في كتلة CPMG لقمع القطع الأثرية المعتمدة على الإزاحة6 ويتم ترميزها للحصول على العديد من التجارب المتشابكة. هذه التجارب interleaved لها فترة استرخاء متطابقة ولكن أعداد مختلفة من نبضات إعادة التركيز من أجل تحقيق مختلف الحقول CPMG7. من المهم أيضا ملاحظة أن برنامج النبض الموصوف يقيس 15N R2 من مكون TROSY لإشارة NMR8. عموما، تم تطبيق البروتوكول بنجاح لتوصيف التبادل التوافقي في البروتينات متوسطة وكبيرة الحجم4،5،9،10. بالنسبة للأنظمة الأصغر (&lt;20 كيلودا)، ينصح باستخدام تسلسل النبض الذبذبي الأحادي الترونو نووي (HSQC)11و12.

<table><tbody><tr><td>مسبار التبريد Cryoprobe</td><td>Bruker</td><td>5mm TCI 800 H-C / N-D المسبار المبرد</td><td>تحسين الحساسية</td></tr><tr><td>أكسيد الديوتيريوم</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>756822-1</td><td>>99.8٪ نقي ، يستخدم في تحضير عينات الرنين المغناطيسي النووي والثقافات الديوتيريتية أجهزة</td></tr><tr><td>الطرد المركزي التي تعمل باليد</td><td>CENTFG1 التوريد العلمي المتحدة</td><td></td><td>تستخدم لإزالة أي فقاعات هواء أو سائل متبقي عالق على جدران أنبوب الرنين المغناطيسي النووي.</td></tr><tr><td>مطياف الرنين المغناطيسي النووي عالي المجال</td><td>Bruker</td><td>Bruker Avance II 600 ، Bruker Avance 800</td><td>الحصول على بيانات الرنين المغناطيسي</td></tr><tr><td>النووي MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html</td><td>نمذجة بيانات الرنين المغناطيسي</td></tr> النووي <tr><td>ماصة الرنين المغناطيسي النووي ماصة</td><td>Corning Incorporation</td><td>7095D-NMR</td><td>ماصة زجاجية Pyrex لنقل عينة سائلة في أنبوب الرنين المغناطيسي</td></tr> النووي <tr><td>أنبوب الرنين المغناطيسي</td> النووي <td>Willmad Precision</td><td>535-PP-7</td> 5 <td>مم جدار رفيع 7 بوصات أنبوب زجاجي أسطواني</td></tr><tr><td>NMRPipe</td><td>معهد العلوم البيولوجية وأبحاث التكنولوجيا الحيوية</td><td>https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html</td><td>معالجة بيانات الرنين المغناطيسي</td></tr> النووي <tr><td>SPARKY</td><td>جامعة كاليفورنيا ، سان فرانسيسكو</td><td>https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/</td> <td>تحليل بيانات الرنين المغناطيسي</td></tr> النووي <tr><td>Tospin 3.2 (أو أحدث)</td><td>Bruker</td><td>https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html</td><td>برامج الاستحواذ</td></tr></tbody></table>

15 n cpmg التشتت الاسترخاء للتحقيق في ديناميات تشكيل البروتين على مقياس زمني μs-ms

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

تلعب الديناميكيات التوافقية للبروتين أدوارا أساسية في تنظيم الحفز الأنزيمي ، وربط الليغند ، والتستوستيرون ، والإشارات ، وهي عمليات بيولوجية مهمة. إن فهم كيفية تحكم التوازن بين البنية والديناميكيات للوظيفة البيولوجية هو حدود جديدة في البيولوجيا الهيكلية الحديثة وأشعل العديد من التطورات التقنية والمنهجية. من بين هذه, CPMG الاسترخاء حل التشتت أساليب NMR توفير فريدة من نوعها, معلومات الدقة الذرية على هيكل, الحركية, والديناميكا الحرارية من البروتين تشكيلية التوازنات التي تحدث على مقياس زمني μs-ms. هنا ، تقدم الدراسة بروتوكولات مفصلة للحصول على وتحليل تجربة تشتت الاسترخاء 15N. على سبيل المثال ، يظهر خط أنابيب لتحليل ديناميات μs-ms في المجال C-terminal من البكتيريا Enzyme I.

البروتوكول الموصوف هنا يؤدي إلى الحصول على ملامح RD لكل ذروة في الطيف 1H-15N TROSY(الشكل 3A). من ملامح RD المكتسبة، فمن الممكن لتقدير مساهمة الصرف إلى الاسترخاء العرضي N 15من كل مجموعة أميد العمود الفقري(الشكل 3A،3B). من خلال رسمR السابقين على هيكل 3D من البروتين قيد التحقيق، فمن الممكن لتحديد المناطق الهيكلية التي تمر تبادل تشكيلي على مقياس الوقت μs-ms(الشكل 3C). إرجاع ال...

هنا، يتم توفير وصف مفصل للبروتوكول المنفذ في المختبر للحصول على وتحليل 15N ملامح التشتت الاسترخاء عن طريق التحليل الطيفي NMR الحل.

15 N CPMG التشتت الاسترخاء للتحقيق في ديناميات تشكيل البروتين على مقياس زمني μs-ms

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

يمكن استخدام هذا البروتوكول للكشف عن الديناميكيات التوافقية للبروتين وتوصيفها، وهي ضرورية لفهم مجموعة كبيرة ومتنوعة من العمليات الخلوية. بالمقارنة مع الطرق الأخرى ، لا تتطلب هذه الطريقة خطوات إعداد عينات متخصصة وتوفر توصيفا شاملا للحراك والديناميكا الحرارية والجوانب الهيكلية للتوازن التأكيدي. CPMG التشتت الاسترخاء يمكن تطبيقها على نطاق أوسع لتوصيف ديناميات تأكيدية في الأحماض النووية والجزيئات الحيوية الأخرى، وكذلك لتوصيف التفاعلات الجسيمات النانوية ليغاند.يستهدف بروتوكولنا مستخدمي CPMG لأول مرة. لذلك فهي نقطة انطلاق جيدة. ومع ذلك، نتوقع من المستخدمين معرفة الخطوات الأساسية لتشغيل تجارب NMR التقليدية.لإعداد تجربة NMR لأول مرة، قم بتنزيل هذه الملفات التكميلية وفك ضغطها أولا. نسخ البتات. vv و trosy_15N_CPMG.vv الملفات في مجلد برنامج نبض لدليل برنامج نبض. افتح برنامج الاستحواذ واستخدم أمر EDC لنسخ تجربة النيتروجين الهيدروجيني 15 HSQC التي تم تشغيلها سابقا إلى تجربة جديدة. استخدم الأمر برنامج النبض لتحميل trosy_15N_CPMG.ملف برنامج نبض vv في التجربة التي تم إنشاؤها حديثا. ثم استخدم الإرشادات من نهاية ملف برنامج النبض لإعداد تجربة CPMG. لإعداد تجربة NMR روتينية، أدخل العينة إلى المغناطيس وتنفيذ جميع خطوات اكتساب NMR الأساسية.تعيين P1 لمدة الهيدروجين الثابت 90 درجة البقول وP7 لمدة النيتروجين 15 الثابت 90 درجة البقول. في نافذة الاستحواذ، قم بتعيين عرض الوسط والعرض الطيفي لأبعاد الهيدروجين والنيتروجين 15. تعيين تأخير الاسترخاء إلى T2 0.7 واستخدام الأمر قائمة VC لإنشاء قائمة أرقام عدد صحيح المقابلة N.After التأكد من أن كل إدخال في القائمة يتوافق مع حقل CPMG مختلفة وفقا لCPMG قدم يساوي 4N مقسوما على D30، تحقق من أن الرقم الأول في القائمة هو صفر.تعيين L8 إلى عدد الإدخالات في قائمة VC، L3 إلى عدد من النقاط الحقيقية للبعد غير المباشر، و 1TD إلى L8 مرات L3 مرتين. لتحسين قمع المياه، تعيين كسب المتلقي إلى واحد واكتب سحب EDC لفتح ملف برنامج نبض. على السطر 91 إزالة الفاصلة المنقوطة السابقة goto 999 وحفظ الملف.باستخدام الأمر GS، قم بضبط معلمات SPDB0 لتقليل كثافة إشارة FID. عند تعديل كثافة الإشارة، أعد إدخال منقوطة عند السطر 91 من ملف برنامج النبض واحفظ الملف. لتحسين SPDB11، تعيين كسب المتلقي إلى واحد وسحب EDC نوع لفتح ملف برنامج نبض.على السطر 168 إزالة الفاصلة المنقوطة السابقة goto 999 وحفظ الملف. باستخدام الأمر GS، قم بضبط معلمات SPDB11 لتقليل كثافة إشارة FID. عند تعديل كثافة الإشارة، أعد إدخال الفاصلة المنقوطة عند السطر 168 واحفظ الملف.لتحسين SPDB2، تعيين كسب المتلقي إلى واحد وأدخل سحب EDC لفتح ملف برنامج نبض. على السطر 179 إزالة الفاصلة المنقوطة السابقة goto 999 وحفظ الملف. باستخدام الأمر GS، قم بضبط معلمات SPDB2 لتقليل كثافة إشارة FID.عند تعديل كثافة الإشارة، إعادة إدخال منقوطة في السطر 179 من ملف برنامج النبض وحفظ الملف. لتحسين PLDB2، تعيين كسب المتلقي إلى واحد وأدخل سحب EDC لفتح ملف برنامج نبض. على السطر 184 إزالة الفاصلة المنقوطة السابقة goto 999 وحفظ الملف.باستخدام الأمر GS، قم بضبط معلمات PLDB2 لتقليل كثافة إشارة FID. عند تعديل كثافة الإشارة، أعد إدخال الفاصلة المنقوطة في السطر 184 من ملف برنامج النبض واحفظ الملف. تشغيل الأمر RGA لتحسين كسب المتلقي.ثم قم بتشغيل الأمر ZG لبدء التجربة. في هذا الرقم، يمكن ملاحظة نتائج ملامح تشتت الاسترخاء المكتسبة لكل ذروة في طيف النيتروجين الهيدروجيني 15 Trosy. من ملامح تشتت الاسترخاء المكتسبة ، من الممكن تقدير مساهمة التبادل في الاسترخاء العرضي النيتروجين 15 لكل مجموعة AMI العمود الفقري.من خلال التخطيط للاسترخاء العرضي على البنية ثلاثية الأبعاد للبروتين قيد التحقيق ، من الممكن تحديد المناطق الهيكلية التي تخضع لتبادل تأكيدي على مقياس الوقت مللي ثانية ميكروثانية. إرجاع النمذجة من منحنيات التشتت الاسترخاء باستخدام المعادلات كارفر ريتشاردز المعلمات الحرارية والحركية على عملية التبادل، مثل السكان كسور من الدول في التوازن ومعدل التبادل بين هذه الدول. ويمكن بعد ذلك أن يكون الاعتماد على درجة الحرارة من هذه المعلمات الحرارية والحركية على غرار باستخدام المعادلات فانت هوف وحلقة I، على التوالي، للحصول على معلومات مفصلة عن حيوية تبادل تأكيدي.ومن الأهمية بمكان تحسين جميع معايير الاستحواذ بعناية، ولا سيما P7. ومن المهم أيضا إنتاج عينات نقية ومتجانسة للغاية لتجنب التشتت الزائف. ويمكن استخدام معلمات الرقائق الحركية والديناميكية الحرارية والكيميائية التي تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول لاستخلاص معلومات نشطة وهيكلية عن الأنواع التي تخضع للتبادل التأكيدي. توصيف ديناميات تأكيد البروتين التي تم الحصول عليها من قبل أساليب CPMG يوفر معلومات حاسمة نحو فهم الإشارات والنشاط الأنزيمي، فضلا عن وجهات نظر جديدة لتصميم المخدرات.

15n-cpmg-relaxation-dispersion-for-investigation-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

الكيمياء الحيوية

هياكل الجمعيات البروتين سوبراموليكولار في قرار الذرية ذات أهمية عالية نظراً لدورهم الحاسم في مجموعة متنوعة من الظواهر البيولوجية. وهنا، نقدم بروتوكولا لإجراء دراسات الهيكلية ذات الدقة العالية على التجميعات البروتين الجزيئات غير قابلة للذوبان وغير البلورية بالسحر-زاوية الغزل مطيافية الرنين المغناطيسي النووي الصلبة (سنمر ماس).

الحجم الذري الدراسات الهيكلية للتجميعات الجزيئات بالتحليل الطيفي الرنين المغناطيسي النووي الصلبة

يمكن أن يميز التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (NMR) ديناميكيات البروتين الهيكلية بطريقة خاصة بالبقايا. نحن نقدم بروتوكولا عمليا لتسجيل استرخاء الرنين المغناطيسي النووي 15و N R1 و R2 و {1H}-15N تجارب تأثير Overhauser غير المتجانسة (hetNOE) ، الحساسة للمقياس الزمني للبيكو ثانية إلى النانو ثانية.

تجارب الاسترخاء NMR 15N للتحقيق في الديناميكيات الهيكلية للبروتينات بيكو ثانية إلى نانو ثانية

يبحث هذا البروتوكول المستند إلى الرنين المغناطيسي النووي في التفاعلات الضعيفة بين البروتين والجليكان باستخدام سيانوفيرين-N و D-مانوز. من خلال الجمع بين الطرق المكتشفة بالترابط والبروتين ، فإنه يرسم خرائط لمواقع الربط ، ويكتشف التأثيرات الخيفية ، ويحدد مجمعات المواجهة. يحدد النهج إعداد العينات وتحليل البيانات ، ويقدم رؤى هيكلية وديناميكية قيمة لآليات التشخيص والتعرف الخاصة بالجليكان.

استكشاف تفاعلات البروتين والجليكان: التقدم في الرنين المغناطيسي النووي

تصف هذه الورقة طريقة لتقييم تفاعلات وتجميعات بروتينات الغشاء المتكاملة في المختبر مع عوامل شريكة مختلفة في بيئة شحمية قريبة.

باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب في المختبر

المرونة بتكوين تلعب دورا حاسما في وظيفة البروتين. هنا، نحن تصف استخدام تأين بالإرذاذ الإلكتروني مطياف الكتلة وقت حل جانب لصرف الهيدروجين الديوتيريوم للتحقق التغييرات الهيكلية السريعة التي تدفع وظيفة في البروتينات أمر والمختلين.

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

هنا يمكننا وصف بروتوكول بسيط لسرعة إنتاج مئات من وسائط النمو السلكية أجار، لوحات الثقافة 96-جيدا مع أرقام متسقة من ايليجانس كاينورهابديتيس لكل بئر. هذه الثقافات مفيدة لفحص الكائنات كله المظهرية. نحن نركز هنا على استخدام هذه الثقافات إلى شاشة المواد الكيميائية للآثار المؤيدة طول العمر.

طريقة بسيطة لفحص المواد الكيميائية عالية الإنتاجية في ايليجانس كاينورهابديتيس

واحد من شروط الضغط الأكثر تحديا التي تواجهها الكائنات الحية خلال حياتهم ينطوي على التراكم للتأكسد. خلال الأكسدة، خلايا تعتمد بشدة على مرافقين الجزيئية. نقدم هنا، الأساليب المستخدمة في التحقيق ينظم الأكسدة التجميع المضادة النشاط، وكذلك فيما يتعلق برصد التغيرات الهيكلية التي تنظم وظيفة وصي باستخدام HDX--مرض التصلب العصبي المتعدد.

تعريف النشاط وصي ينظم الأكسدة والاختزال في Hsp33 وتعيين التغييرات كونفورماشونال في Hsp33 باستخدام الهيدروجين الديوتريوم التبادل الكتلي

تفاعلات البروتين البروتين حاسمة بالنسبة للنظم البيولوجية، والدراسات المتعلقة بحركية ملزمة التبصير بديناميات ووظيفة البروتين المجمعات. يمكننا وصف أسلوب التي يوضحها المعلمات الحركية بروتين معقدة باستخدام أسلوب توقف تدفق ونقل الطاقة صدى الأسفار.

استخدام الأنابيب الفلورية الرنين نقل الطاقة لدراسة ديناميات البروتين المجمعات في مقياس زمني ميلي ثانية

نقدم هنا، بروتوكولا لتقييم تجانس وضع العلامات لكل أنواع البروتين في عينة بروتين معقدة على مستوى جزيء واحد.

تحديد كمية البروتين على نطاق المنظومة وسم التجانس على مستوى جزيء واحد

الهدف من هذا البروتوكول هو إظهار كيفية استخدام المجهر ورقة الضوء شعرية لأربعة الأبعاد تصور ديناميات مستقبلات السطح في الخلايا الحية. هنا يتم عرض مستقبلات الخلايا التائية على CD4+ الخلايا التائية الأولية.

تصور سطح T-خلية مستقبلات ديناميات رباعية الأبعاد باستخدام شعرية الضوء ورقة المجهر

تعلم استخدام تقنية تشتت الاسترخاء CPMG لتحليل ديناميات تشكيل البروتين بدقة ذرية على مقياس زمني μs-ms. هذه الطريقة تُمكّن من دراسة الحركية والديناميكا الحرارية للتفاعلات البيولوجية.

¹⁵ N CPMG التشتت الاسترخاء للتحقيق في ديناميات تشكيل البروتين على مقياس زمني μs-ms

استكشف المزيد من الفيديوهات