نهج فقدان الوظيفة في شبكية العين الجنينية باستخدام التعبير الوراثي بوساطة Tol2 transposon للحمض النووي الريبي الدقيق الاصطناعي

توفر هذه المنهجية نهج فقدان الوظيفة لدراسات تطور الشبكية في الفرخ. تدعم هذه التقنية القمع السريع والمستمر للجينات المستهدفة في منطقة معينة من شبكية العين. يمكن أيضا تطبيق هذا النهج على أجزاء أخرى من جنين الفرخ ، بما في ذلك الأنسجة العصبية وغير العصبية.

بالنسبة للتثقيب الكهربائي للبيض ، قم بإعداد محلول أخضر سريع بنسبة 0.25٪ عن طريق إذابة 25 ملليغرام من Fast Green FCF في 10 ملليلتر من PBS ، ثم قم بتصفية المحلول باستخدام مرشح حقنة 0.2 ميكرون. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول حقن كوكتيل الحمض النووي عن طريق خلط بلازميد الزمرد GFP microRNA مع بلازميد تعبير Tol2 transposase بنسبة اثنين إلى واحد. ثم أضف محلول Fast Green المحضر إلى كوكتيل الحمض النووي بنسبة واحد إلى 10 لتصور المنطقة المحقونة.

بعد ذلك ، قم بإعداد جهاز الحقن المجهري. يتكون الجهاز من حقنة هاملتون ، وإبرة قياس 18 بوصة بوصتين ، وأنبوب كلوريد البولي فينيل بطول سنتيمترين ، وإبرة ماصة دقيقة. املأ حقنة هاملتون بالزيت المعدني الثقيل ، ثم قم بتوصيل إبرة قياس 18 بالمحقنة ، واملأ المساحة الداخلية للإبرة بالزيت عن طريق الضغط على مكبس المحقنة.

بعد ذلك ، قم بتوصيل أنبوب البولي فينيل كلوريد بنهاية الإبرة ، واملأ الأنبوب بالزيت. قم بتوصيل إبرة الماصة الدقيقة المسحوبة بالأنبوب. ثم تحت المجهر التشريحي باستخدام ملقط دقيق ، قم بقطع طرف الإبرة إلى قطر 10 إلى 20 ميكرومتر لعمل فتحة صغيرة.

املأ الإبرة بأكملها بالزيت. بعد ذلك ، ضع خمسة ميكرولترات من كوكتيل الحمض النووي الملون على طبق بتري. تحت المجهر التشريحي ، ضع طرف إبرة الماصة الدقيقة في محلول الحمض النووي على طبق بتري ، وارسم المحلول ببطء في الإبرة.

بعد توازن الضغط داخل الإبرة وخارجها ، أخرج طرف الإبرة من محلول الحمض النووي ، واحتفظ بها مغمورة في برنامج تلفزيوني معقم في دورق صغير حتى الحقن. ثم لإعداد جهاز التثقيب الكهربائي ، قم بتعيين زوج من الأقطاب الكهربائية البلاتينية بإحكام مع حامل قطب كهربائي على معالج دقيق. اضبط التباعد بين طرف الأقطاب الكهربائية إلى ملليمترين ، وقم بتوصيل الأقطاب الكهربائية بمولد نبض موجة مربعة مع كابلات.

بعد ذلك ، بالنسبة للحقن المجهري للحمض النووي ، قم بإزالة بيضة White Leghorn المخصبة من الحاضنة وامسح سطح البويضة بورق مناديل مبللة بالإيثانول بنسبة 70٪. ثم قم بتوصيل إبرة قياس 18 بحقنة سعة 10 ملليلتر ، وأدخل الإبرة من خلال الطرف الحاد للبيضة ، بزاوية لأسفل لتجنب إتلاف صفار البيض. بعد سحب ملليلتر إلى ثلاثة ملليلتر من الألبومين من البويضة ، أغلق الفتحة بقطعة من شريط سكوتش ، وقم بشموع البيضة بالضوء لضمان فصل الجنين وغشاء vitelline عن القشرة.

بعد ذلك ، باستخدام ملقط ، قم بإزالة قطعة من قشرة البيضة من أعلى البويضة ، وفضح الجنين. لا تقم بنافذة أكثر من خمس بيضات في وقت واحد لمنع جفاف الأجنة أثناء التثقيب الكهربائي. أدخل طرف الإبرة في الحويصلة البصرية من جانبها القريب بزاوية 45 درجة ، وقم بحقن كوكتيل الحمض النووي عن طريق الضغط ببطء على المكبس حتى يملأ المحلول الأزرق اللون التجويف.

اسحب الإبرة ، ثم ضع طرفها مرة أخرى في برنامج تلفزيوني. للتثقيب الكهربائي ، اضبط جهد النبض على 15 فولت ، وطول النبضة على 15 مللي ثانية ، والفاصل الزمني للنبض على 915 مللي ثانية ، وعدد النبض على خمسة. بعد إضافة بضع قطرات من HBSS على غشاء vitelline فوق الجنين ، استخدم المعالج الدقيق لخفض الأقطاب الكهربائية في HBSS عموديا على المحور الأمامي الخلفي للجنين.

ضع الأقطاب الكهربائية على جانبي الحويصلة البصرية ، وتأكد من أن الأقطاب الكهربائية لا تلمس الجنين أو الأوعية الدموية ، ثم ضع المجالات الكهربائية النبضية. بعد اكتمال التثقيب الكهربائي ، قم بإزالة الأقطاب الكهربائية ، ونظف الأقطاب الكهربائية برفق باستخدام قطعة قطن معقمة مبللة بالماء لتجنب تراكم الألبومين. أغلق النافذة بشريط سكوتش ، وأعد احتضان الجنين حتى مرحلة النمو المطلوبة.

أدى نقل تسلسلات ما قبل الحمض النووي الريبي الميكروي الفردية إلى خلايا Nel AP التي تعبر عن خلايا HEK293T إلى قمع كبير لتعبير Nel من خلال التركيبات ضد النيوكليوتيدات 482 إلى 502 ، و 910 إلى 930 ، و 2461 إلى 2481. أدى تسلسل تسلسل microRNA إلى تحسين كفاءة الضربة القاضية بشكل كبير. أظهرت جميع المجموعات الثلاث أنشطة قمع محسنة مقارنة بتسلسلات ما قبل الحمض النووي الريبي الميكروي الفردية غير المقيدة.

لوحظ قمع قوي بعد 13 يوما على الأقل من النقل. عندما تم نقل بنية Nel pre-microRNA التي تستهدف النيوكليوتيدات 482 إلى 502 و 2461 إلى 2481 مع ناقل تعبير transposase إلى شبكية العين ، تم تقليل تعبير Nel في ظهارة صبغة الشبكية بشكل كبير في خلايا التعبير عن GFP الزمردي في اليوم الجنيني 4.5. في الأجنة البالغة من العمر ثمانية أيام ، انخفض تعبير نيل أيضا في خلايا العقدة الشبكية.

في المقابل ، لم يتأثر تعبير نيل في شبكية العين بإدخال الحمض النووي الريبي الميكروي الضابط. باتباع هذا الإجراء ، يمكن فحص التأثيرات على قمع الجينات المستهدفة باستخدام طرق مختلفة مثل فحوصات تكاثر الخلايا وتمايزها ، وموت الخلايا ، وتتبع الخلايا والمحور العصبي.