تلطيخ immunofluorescent لتصور البروتينات المرتبطة Heterochromatin في الغدد اللعابية Drosophila
أغسطس 21, 2021
يهدف هذا البروتوكول إلى تصور مجاميع الهتيروماتين في خلايا البوليتين Drosophila.
والهدف من هذا البروتوكول هو تصور المجاميع heterochromatin في خلايا Drosophila. لتحقيق ذلك ، نستخدم خلايا البوليتين الموجودة في الغدد اللعابية ليرقات النجمة الثالثة يتم تضخيم جينوم هذه الخلايا ما يقرب من ألف مرة ، وتحافظ الكروموسومات على ميزات خلايا الواجهة. لديهم التيلوميرات محددة جيدا، والجسور تسمى chromocenter التي تجمع جميع centromeres، وانها أساسا غير لوني.
باستخدام أنسجة يرقات النجوم الثالثة ، اسمح لنا أيضا بتقييم التغيير في المجاميع غير اللونية في خلفية المسوخ الجينية المختلفة. لتحسين ثقافة يرقات النجوم الثالثة ، ستحتاج أولا إلى جمع البالغين من العمر 5 إلى 10 أيام ، ووضع حوالي 50 في زجاجة عنق واسعة من الوسائط القياسية. 25 ذكر و 25 أنثى.
ضع الزجاجة في حاضنة درجة حرارة خاضعة للرقابة عند 25 درجة مئوية لمدة 12 ساعة. بعد انتهاء فترة الحضانة، قم بإزالة البالغين ونقلهم إلى زجاجة جديدة لتكرار الإجراء. دع الأجنة تنمو عند 18 درجة مئوية لمدة 22 ساعة.
لجمع اليرقات ، تأكد من اختيار اليرقات الهائمة ، والتي ليس لديها كروية علنية. تشريح 15 زوجا من الغدد اللعابية، أو بقدر ما تستطيع في فترة 30 دقيقة في برنامج تلفزيوني الباردة مع مثبطات الاحتجاج تحت المجهر. نقل الغدد اللعابية إلى أنبوب آخر مع الجليد البارد PBS.
غسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني الباردة بالإضافة إلى مثبطات الاحتجاجات. تذكر، انتظر دائما حتى يصل النسيج إلى أسفل الأنبوب. بعد إزالة برنامج تلفزيوني من الخطوة الأخيرة، إضافة مباشرة 0.5 ملليلتر من واحد X مجموعة تثبيت اللثة العازلة و 50٪ الميثانول بالإضافة إلى 2٪ الفورمالديهايد.
احتضان لمدة ساعتين في درجة مئوية أربع مع تناوب معتدل. نفذ غسيل دوران لمدة خمس دقائق مع مخزن Tris-Triton المؤقت ، مع إضافة ملليلتر واحد. انتظر دائما حتى يصل النسيج إلى أسفل الأنبوب.
ملاحظة: انتظر حتى يصل النسيج إلى أسفل الأنبوب. احتضان الغدد اللعابية مع تريس تريتون، نفس أعلاه، بالإضافة إلى 1٪ من بيتا ميركابتوثانول لمدة ساعتين في 37 درجة مئوية مع اهتزاز خفيف. اغسل مع مخزن BO3 العازل، واحتضن مع BO3 بالإضافة إلى 10 ملليمولار DTT في 37 درجة مئوية مع اهتزاز خفيف لمدة 15 دقيقة.
في نهاية فترة الحضانة، قم بإجراء غسلة مع ملليلتر واحد من العازلة BO3 وحدها. احتضان الغدد اللعابية في ملليلتر واحد من العازلة B لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة مع التناوب. إزالة كافة المخزن المؤقت B وإضافة المخزن المؤقت A زائد الأجسام المضادة ذات الفائدة.
في هذه الحالة، نستخدم HP واحد، A C 1 8 9 من بنك إيريديوم. 1 في 3، 000 أكثر من ليلة في أربع درجات مع التناوب. عند هذه النقطة من المهم أن الهز لا يثير فقاعات، والتي قد تضر الأجسام المضادة.
إعطاء علاج من قبل 15 دقيقة يغسل مع العازلة B، تحت اثارة في درجة حرارة الغرفة باستخدام ملليمتر واحد في كل مرة. يتم نقل الغدد إلى العازلة B جنبا إلى جنب مع الزوجين المضادات الحيوية الثانوية إلى الكلمة الرجوع لمدة ساعتين، تحت التناوب في أربع درجات. في هذه الخطوة، من المهم تغطية الأنبوب بورق الألومنيوم لحماية الجسم المضاد الثانوي من الضوء.
قم بإجراء غسالات 2x15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، في حين أن الدوران مع ملليلتر واحد من B.Incubate العازلة مع علامة الحمض النووي مثل Sydox أو OH ، ويذوب في ملليلتر واحد من العازلة B لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الدوران. قم بإجراء غسل واحد مع العازلة B ومرة واحدة مع PBS، كل غسل يدوم 10 دقائق، في حين تدور في درجة حرارة الغرفة. وأخيرا، جبل الغدد اللعابية على الشريحة، مما يجعل بركة مع زلة غطاء.
وضع الغدد اللعابية في منتصف حمام السباحة وتغطي مع Sidiflor. لتجنب تشوه الفقاعة ، وتوسيع السائل اللزج في كل مكان. ثم ختم جميع الشرائح مع طلاء الأظافر واضحة.
مراقبة تحت المجهر مضان أو confocal. إذا كانت العينة لن يتم ملاحظتها في نفس اليوم ، فقم بتخزينها من الضوء عند أربع درجات. تظهر النتائج التمثيلية لداء أحادي الكبد 1 في الغدد اللعابية Drosophila في الشكل الأول.
والنتيجة الإيجابية هي ملاحظة نقطة محورية واحدة كما هو الحال في A، أو تجميع لوني أثيري أو مكثفات. والنتيجة السلبية هي عدم وجود إشارة أو إشارة مشتتة. في بعض الأحيان ، يمكن ملاحظة إشارة مزدوجة مثل نقطة مزدوجة في C ، ولكن عادة ما تحدث بكميات أصغر.
لتحليل البيانات التي يمكن أن تمثل كرسم بياني شريطي ، مقارنة توزيع HP1 مع خلفيات متحولة مختلفة. على سبيل المثال، في الشكل الثاني، يمكننا أن نرى أن 98٪ من النوى تقدم توزيع نقطة واحدة. و2٪ من بؤرتين في النوع البري.
في متحولة، تغيرت النسبة، ووجود اثنين من بؤر زادت إلى 40٪الشكل الثالث يظهر ممثل تريميثيليشن ليسين 9H3 في أحادية. يؤدي إلى الغدد اللعابية Drosophila مراقبة نقطة محورية واحدة في B، انها نتيجة مواتية في المجموع اللوني أو المكثفات، يمكن أن ينظر إلى إشارة مزدوجة أو ثلاثية في C في مناسبة نادرة، ولكن بكميات صغيرة. في نهاية هذا البروتوكول، سوف تكون قادرة على رؤية المكثفات diachromatic من بروتين HP1 على الرغم من القيود المفروضة على الدولة، وسوف يكون النهج الأول جيدة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
المراجع
يهدف هذا البروتوكول إلى تصور تجميعات الكروماتين المتغاير في خلايا ذبابة الفاكهة متعددة الكروموسومات. من خلال استخدام الجينوم المضخم لهذه الخلايا، يستكشف الباحثون خصائص الكروماتين المتغاير من خلال خلفيات جينية مختلفة.
مكونات الدراسة الرئيسية
منطقة البحث
- بيولوجيا الخلية
- علم الوراثة
- بيولوجيا التطور
الخلفية
- توفر خلايا ذبابة الفاكهة متعددة الكروموسومات فرصة فريدة لدراسة تنظيم الكروماتين.
- تكشف الكروموسومات متعددة الكروموسومات عن ميزات هيكلية مهمة محفوظة في الخلايا الوسيطة.
- يساعد فهم سلوك الكروماتين المتغاير في فك رموز الآليات الجينية في خلفيات متحولة مختلفة.
الطرق المستخدمة
- تقنيات الفحص المجهري بالفلورسنت للتصوير
- ذبابة الفاكهة ككائن نموذجي
- البروتوكول الذي يتضمن تشريح الأنسجة، التثبيت، وتلطيخ الأجسام المضادة
النتائج الرئيسية
- تصور ناجح لتجميعات الكروماتين المتغاير لتقييم تأثير الطفرات الجينية.
- تحديد اختلافات كبيرة في عدد البؤر بين الذباب من النوع البري والذباب المتحول.
- التحقق من استخدام بروتين HP1 كعلامة لدراسة سلوك الكروماتين المتغاير.
الخلاصات
- توضح هذه الدراسة بروتوكولًا موثوقًا لتقييم هياكل الكروماتين في ذبابة الفاكهة.
- تساهم النتائج في فهم أعمق للتنظيم الجيني وديناميات الكروماتين.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Visualizing heterochromatin dynamics in model systems supports target validation by clarifying chromatin-associated protein localization and function. This approach enables mechanistic de-risking of epigenetic targets through quantitative assessment of nuclear condensates across genetic backgrounds. The method provides predictive confidence in early discovery by linking chromatin architecture to phenotypic outcomes in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of heterochromatin-associated protein distribution to clarify target engagement and nuclear localization.
- Operational Value: Uses polytene chromosome amplification to enhance signal detection and reduce false-negative readings in protein aggregation assays.
- Predictive Value: Supports phenotypic screening by quantifying foci formation as a functional readout of chromatin state modulation.
Assay Development & Screening
- Scientific Value: Generates quantitative imaging readouts (e.g., foci number and distribution) for high-content analysis of chromatin-modulating compounds.
- Operational Value: Standardizes fixation, staining, and imaging protocols to ensure reproducibility across mutant and treatment conditions.
- Scalability: Enables parallel processing of salivary glands from multiple genetic backgrounds for comparative target validation.
Translational Biomarker Alignment
- Scientific Value: Links HP1 foci patterns to heterochromatin integrity, supporting biomarker development for epigenetic dysregulation.
- Operational Value: Provides a disease-relevant system to model chromatin alterations observed in preclinical models of cancer and developmental disorders.
- Predictive Confidence: Enables risk-adjusted advancement decisions by correlating chromatin condensate formation with functional genetic perturbations.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where chromatin target engagement and nuclear localization require direct visualization prior to biochemical or functional assays.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing of heterochromatin protein function through direct observation of nuclear aggregates in intact cells.
- Assay Readiness: Produces standardized, quantitative imaging outputs suitable for automation in screening campaigns targeting chromatin regulators.
- Analytics: Enables statistical comparison of foci distribution (e.g., single vs. double foci) to quantify treatment or genetic effects on chromatin organization.
- Translational Continuity: Supports biomarker alignment by establishing chromatin condensation as a measurable phenotypic endpoint in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for epigenetic target validation across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in epigenetic target validation by providing direct visual evidence of protein-chromatin interactions.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized tissue preparation, antibody staining, and confocal imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of off-target chromatin effects that may lead to late-stage toxicity.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of epigenetic targets based on quantitative chromatin condensation phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila tissue dissection, immunofluorescence staining, and confocal microscopy.
- Dependent on access to fluorescence or confocal microscopes with appropriate filter sets for fluorophore detection.
- Necessitates standardization of antibody incubation, washing, and blocking conditions across laboratories.
- Adaptation to other model systems may require optimization of fixation and permeabilization steps due to differences in chromatin structure.
- Practical limitations include tissue fragility during handling and potential epitope masking from over-fixation, as noted in the protocol.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:01
Third Instar Larvae Culture
1:51
Larvae Collection
2:49
Salivary Gland Tissue Fixation
3:20
Salivary Gland Tissue Wash
3:55
Permeabilization Step
4:17
Salivary Gland Tissue Wash
4:55
Tissue Blocking Step
5:13
Immunostaining
8:01
Representative Results
9:50
Conclusion
