المجهر أحادي الجسيمات كريو إلكترون: من عينة إلى هيكل
May 29th, 2021
أصبح تحديد هيكل المجمعات الجزيئية الكبيرة باستخدام cryoEM روتينيا لفئات معينة من البروتينات والمجمعات. هنا، يتم تلخيص هذا الخط (إعداد العينات، والفحص، والحصول على البيانات ومعالجتها) ويتم توجيه القراء نحو المزيد من الموارد التفصيلية والمتغيرات التي يمكن تغييرها في حالة العينات الأكثر تحديا.
أصبح تحليل التبريد-EM أحادي الجسيمات تقنية روتينية في صندوق أدوات عالم الأحياء الهيكلي المطبق على مجموعة واسعة من العينات بما في ذلك بروتينات الأغشية والفيبريلات الأميلويد والبروتينات والفيروسات الملزمة لحمض النوى. وبمجرد الانتهاء من إعداد العينات وتحميل الشبكات في المجهر، يمكن جمع البيانات عن بعد في العديد من مرافق التبريد و EM مثل مختبر أستبري للهياكل الحيوية وeBIC. غالبا ما تكمن الحواجز الرئيسية أمام تحديد الهيكل الناجح في مراحل إعداد العينة وفحص الشبكة مع تكرارات متعددة مطلوبة أحيانا من خلال هذه العملية.
هنا، سوف نظهر فحص الشبكة عن بعد والحصول على بيانات جسيم واحد. في علامة التبويب محمل تلقائي من واجهة مستخدم المجهر، قم بعلامة التبويب خارج مربع حوار الخيارات باستخدام السهم واضغط على زر المخزون. سيؤدي ذلك إلى التحقق من كل موضع في الكاسيت بشكل تسلسلي لتحديد ما إذا كانت خرطوشة موجودة.
سيتم تشغيل المخزون على كل فتحة بشكل تسلسلي. عند تعيين كافة الفتحات المحتلة، سيتوقف المخزون. قم بتمييز الشبكة التي سيتم نقلها إلى عمود المجهر وانقر فوق الحمل.
ستتحول تسمية الفتحة من اللون الأزرق إلى الأصفر بمجرد تحميل الشبكة بنجاح على المسرح. لفحص الشبكات، افتح برنامج EPU. في صفحة الإعداد، حدد بصريات وإعدادات الاقتناء، ثم حدد إعداد أطلس مسبقا من القائمة المنسدلة.
اختر إعدادات إعداد الحزمة المناسبة واضغط على مجموعة لدفع المعلمات إلى المجهر. اضغط لفتح صمامات العمود وإدخال شاشة الإنفلونزا. تأكد من أن شعاع مرئية وتنتشر بما فيه الكفاية وتركزت لتغطية الكاشف.
إذا لزم الأمر، انتقل إلى منطقة أرق من الشبكة باستخدام عصا التحكم أو لوحات اليد الظاهرية للتحكم في حركات المرحلة في X و Y.Lift شاشة الإنفلونزا وأخذ صورة باستخدام زر المعاينة في وحدة معالجة الرسومات. في وحدة معالجة الرسومات، انتقل إلى صفحة أطلس واضغط على جلسة جديدة. حدد تنسيق صورة MRC وأدخل اسم مجلد وموقع مناسب لحفظ جلسة الفحص، ثم انقر فوق تطبيق.
حدد الفحص من القائمة على اليسار. ضع علامة على مربعات الاختيار بجوار كل شبكة للحصول على مونتاج أطلس ، ثم ابدأ جلسة الفحص في EPU. يتم الحصول على أطلس لكل شبكة تم فحصها ويتم سرد مربعات الشبكة المتاحة عند الانتهاء.
ويمكن الاطلاع على كل أطلس من خلال تسليط الضوء عليه على صفحة الفحص. عند الانتهاء، قم بمراجعة الأطالس المجمعة وحدد الشبكات المناسبة لتقييم جودة العينة في التكبيرات الأعلى. قم بتمييز الشبكة المختارة في قائمة فحص وحدة معالجة الرسومات وانقر فوق عينة التحميل.
من قائمة فحص أطلس، حدد الشبكة المحملة حاليا ونقل المرحلة إلى مربع الشبكة التي تحتوي على ثقوب مملوءة عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن فوق الموقع المطلوب على صورة الشبكة واختيار مرحلة التحرك هنا. العودة إلى صفحة إعداد وحدة معالجة الرسومات وحدد الإعداد المسبق لمربع الشبكة. افتح صفحة الوظائف التلقائية ل EPU واركض تلقائيا إلى مركز التكون عن طريق إمالة المرحلة مع إعداد مربع الشبكة مسبقا لنقل العينة إلى الارتفاع متحد المركز.
في إعداد وحدة معالجة الرسومات ، خذ صورة معاينة مربعة جديدة للشبكة. لاحظ القيم الرمادية عبر ثقوب مختلفة تشير إلى اختلاف سمك الجليد. نقل المرحلة فوق حفرة باستخدام انقر بزر الماوس الأيمن ونقل المرحلة هنا.
حدد الفتحة أو الإعداد المسبق للارتفاع متحد المركز، ثم انقر فوق معاينة. حدد مسبقا الحصول على البيانات وتعيين التكبير الذي يسمح بسهولة تحديد الجسيمات. تعيين إزاحة defocus إلى سالب ثلاثة إلى خمسة ميكرومترات.
يكرر من خلال خطوات لإعادة تقييم مجموعة من سمك الجليد لتوزيع الجسيمات، والتوجه، والتلوث عبر الشبكة. اعتمادا على توافر المجهر، والاستمرار مباشرة إلى جمع البيانات أو يمكن إزالة الشبكات من المجهر لجمع المستقبل بما في ذلك في مواقع أخرى. جمع أطلس إذا كان أحد غير متوفر من الفحص عن طريق إعداد إعدادات أطلس واختيار الشبكة للحصول على أطلس.
الحصول على أطلس وانقر على موقع الشبكة لمعرفة الإخراج. وبمجرد اكتمال الأطلس، حدد كل إعداد من إعدادات الحزم المسبقة وفقا للاحتياجات التجريبية للمشروع. إجراء معايرة إزاحة الصورة.
قم بإعداد جلسة عمل EPU عن طريق تحديد إعداد جلسة عمل صفحة EPU ثم تحديد جلسة عمل جديدة أو جديدة من التفضيلات. بعد تحديد جلسة عمل جديدة، ستظهر نافذة منبثقة توفر خيارا لاستخدام الإعدادات السابقة. سيتم تحميل الإعدادات تلقائيا من جلسة العمل السابقة إلى الحالية وحدة معالجة الرسومات.
بدلا من ذلك، حدد جديدا من التفضيلات واختر ملفا مع التفضيلات المحفوظة للتحميل المسبق لهذه المعلومات في وحدة معالجة الرسومات الحالية. ملء اسم الجلسة مع شيء مفيد. في النوع، حدد يدوي.
لوضع الامتلاك، حدد توسيط الثقب الدقيق أو اكتساب أسرع إذا كانت مجموعة التحولات الحرة للصورة متوفرة وممتهة. حدد تنسيق الصورة المطلوب، ثم حدد مجلد التخزين وستنشئ EPU دليلا باسم الجلسة. حدد الشبكة المناسبة وفقا لتباعد فتحة الشبكة الذي يتم استخدامه واضغط على تطبيق.
حدد مربع شبكة أولية ثم قم بتعيين قالب اكتساب. انتقل إلى التحديد المربع. إذا كانت كافة المربعات خضراء، فانقر فوق إلغاء تحديد الكل في أعلى اليسار.
افتح الإطارات المتجانبة بالنقر بزر الماوس الأيمن ثم حدد الإطار المتجانب المفتوح. إضافة مربع شبكة أو اختياره بالنقر فوق تحديد، ثم النقر بزر الماوس الأيمن وتحديد مرحلة النقل إلى مربع الشبكة. انتقل إلى اختيار حفرة واضغط لصناعة السيارات في eucentric.
انتظر حتى يتم التقاط صورة مربعة للشبكة. إذا فشل الوظيفة التلقائية، قد يكون هذا بسبب ارتفاع بشكل ملحوظ إيقاف. ويمكن تعديلها يدويا باستخدام شاشة الانفلونزا في التكبير مربع الشبكة.
لقياس حجم الثقب، قم بتحريك وضبط الدوائر الصفراء بحيث تكون فوق الثقوب مع الحجم الصحيح والتباعد. اضغط على البحث عن ثقوب. تأكد من أن الثقوب قد تم العثور عليها بشكل صحيح.
إذا لم يكن كذلك، تغيير حجم الثقب واضغط العثور على ثقوب مرة أخرى. إذا فشلت هذه العملية باستمرار، ففكر في الانتقال إلى رقم أقل أو حجم نقطة أكثر سطوعا عند تكبير مربع الشبكة. استخدم مخطط تخطيطي جودة الثلج على اليمين لضبط تحديد الثقب.
وهذا يمكن أن يكون مفيدا لاستبعاد المناطق ذات الجليد السميك والجليد الرقيق. سيتم تذكر هذا المربعات الشبكة المستقبلية المحددة أثناء جلسة العمل. تحسين تحديد الفتحة باستخدام الأدوات الموجودة في القائمة المحددة في الأعلى.
على سبيل المثال، انقر فوق إزالة الثقوب القريبة من شريط الشبكة. انتقل إلى تعريف القالب واضغط على اكتساب. انقر فوق البحث وثقب المركز.
تغيير التأخير بعد مرحلة التحول والتأخير بعد نقل الصورة مرات إلى 1-5 ثوان، ثم إذا كان متوفرا، تحقق من الحد الأقصى لقيمة التحول الصورة كما هو مطلوب. انقر فوق إضافة منطقة الاستحواذ وانقر فوق أي مكان على الصورة. نقل منطقة الاستحواذ إلى الموقع المطلوب.
إضافة نطاق defocus على أعلى اليمين. قائمة ديفوكوس نموذجية لمشروع بروتين الغشاء هو سلبي 0.8 إلى سلبي ثلاثة ميكرومتر ديفوكوس، ثم إضافة مناطق الاستحواذ الأخرى، وترتيبها بحيث لا تتعرض مناطق الاستحواذ بشكل مضاعف مع شعاع. انقر فوق إضافة منطقة التركيز التلقائي وانقر فوق أي مكان على الصورة.
نقل منطقة التركيز التلقائي إلى الكربون المحيطة حفرة. الممارسة القياسية هي التركيز التلقائي بعد التوسيط عند استخدام AFIS أو كل خمسة إلى 15 ميكرومتر اعتمادا على تباين ارتفاع Z عبر المربع. انقر فوق إضافة منطقة قياس الانجراف.
تم إجراء قياس الانجراف مرة واحدة لكل مربع شبكة مع عتبة محددة قدرها 0.05 نانومتر في الثانية كإعداد قياسي. يمكن أن تتداخل منطقة قياس الانجراف مباشرة مع منطقة التركيز التلقائي. تأكد من عدم تداخل منطقة الانحراف أو التركيز التلقائي مع منطقة الاستحواذ.
العودة إلى مربع التحديد وتحديد المربعات لاكتساب على الشبكة. استخدم عدد مناطق الاستحواذ ومعدل الحصول المتوقع على البيانات للتنبؤ بعدد مناطق الاستحواذ المطلوبة. عند تحديد كافة المربعات المطلوبة، اضغط على إعداد كافة المربعات.
بمجرد جمع كل مربع، انتقل بين مربعات الشبكة وصقل الثقوب باستخدام فرشاة التحديد. الانتقال إلى موقع مرحلة فوق العينة واستخدام وظائف السيارات لتعيين ارتفاع eucentric. قم بإجراء محاذاة مجهرية باستخدام برنامج المجهر كما هو موضح سابقا وفي النص.
قم بإجراء محاذاة خالية من الغيبوبة داخل الوظائف التلقائية قبل إعادة إدراج وتوسيط الفتحة الموضوعية وتصحيح الاستجماتيزم البؤري للعدسة الهدف مع وحدة معالجة الرسومات. تأكد من أن كلا المحاذاتين تتلاقى على القيم المناسبة. قبل بدء تشغيل الاستحواذ التلقائي، تأكد من إيقاف تشغيل مضخة توربو محمل السيارات ويتم إدراج الفتحة الهدف إذا لزم الأمر.
في الاستحواذ الآلي، اضغط على بدء التشغيل لبدء الحصول الآلي على البيانات. وباستخدام هذا البروتوكول، يمكن فحص الشبكات المقطوعة أو الجافة والتخلص منها في مرحلة الأطلس. لوحظ تدرج من الجليد عبر معظم الشبكات.
أثناء الفحص ، يتم مونوين توزيع الجسيمات المثالي مع مجموعة من التوجهات الجسيمات مرئية. إذا كان الجليد رقيقا جدا ، فيمكن أن يذوب عندما يضيء بشعاع الإلكترون ، مما يسبب حركة مفرطة في المجهر. ويلاحظ هذا الأكثر شيوعا عندما يكون هناك المنظفات في المخزن المؤقت.
الجليد يحتاج إلى أن يكون الزجاجي حتى مناطق من الشبكة حيث غالبية الصور تظهر الجليد البلوري استبعدت. وقد أدرج موجز بياني للبيانات لتقييم جودة الميكروستوغرافيا وتقرير ما إذا كانت هناك حاجة إلى إدخال تعديلات على جمع البيانات. جامعي الجسيمات مثل crYOLO تعمل بشكل جيد بما فيه الكفاية لتمريرة الأولى من البيانات، وتمكين التقدم إلى متوسط فئة 2D.
وينبغي اختيار الفئات التي تظهر تفاصيل البنية الثانوية للتحليل ثلاثي الأبعاد في حين ينبغي التخلص من الجسيمات غير المرغوب فيها. ويمكن استخدام مجموعة فرعية من الجسيمات لتوليد نموذج أولي للتصنيف 3D والصقل. وفي حالة RagAB، تضمنت مجموعة البيانات ثلاثة مطابقين متميزين يمكن فصلهم أثناء التصنيف ثلاثي الأبعاد.
من المهم أن نتذكر أن النجاح في الحصول على البيانات والخطوات اللاحقة لتحليل الصور تعتمد على الحصول على وتحديد الشبكات المحسنة بشكل جيد خلال مرحلة الفحص. بمجرد الحصول على خريطة كثافة 3D EM ، يمكن تفسيرها بشكل أكبر من خلال تركيب وتكرير نموذج البروتين أو بناء نموذج ذري de novo. يتيح تحليل الجسيمات المفردة Cryo-EM التحديد المنظم للعديد من الأهداف التي لم تكن ممكنة من قبل.
وتجدر الإشارة إلى أن مهام سير العمل هذه قد استخدمت مؤخرا لحل هياكل الجزيئات الكلية ذات الصلة COVID-19.
نظرة عامة
تُلخص هذه المقالة تحديد بنية المجمعات الجزيئية الكبيرة باستخدام التصوير المجهري بالتبريد الإلكتروني (cryo-EM)، مع تفصيل الخطوات من تحضير العينة إلى اكتساب البيانات. كما تسلط الضوء على أهمية فحص الشبكة وتوفر رؤى حول التحديات التي تمت مواجهتها أثناء العملية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأحياء البنيوي
- التصوير المجهري بالتبريد الإلكتروني
- المجمعات الجزيئية الكبيرة
الخلفية
- أصبح التصوير المجهري بالتبريد الإلكتروني تقنية روتينية لعلماء الأحياء البنيوية.
- ينطبق على العديد من العينات بما في ذلك البروتينات الغشائية والفيروسات.
- تحضير العينة وفحص الشبكة هما عنصران حيويان لتحديد البنية الناجح.
- جمع البيانات عن بعد ممكن في العديد من مرافق التصوير المجهري بالتبريد الإلكتروني.
هدف الدراسة
- لتلخيص خط سير عمل التصوير المجهري بالتبريد الإلكتروني لتحديد البنية.
- لتوفير الإرشاد بشأن تحضير العينة وفحص الشبكة.
- لتوجيه القراء إلى موارد إضافية للعينات الصعبة.
الطرق المستخدمة
- تحضير العينة وتحميل الشبكة في المجهر.
- فحص الشبكة عن بعد باستخدام برنامج EPU.
- اكتساب البيانات ومعالجة الصور التي تم جمعها.
- التقييم المتكرر لسمك الجليد وتوزيع الجسيمات.
النتائج الرئيسية
- تم إثبات تحميل الشبكة وفحصها بنجاح.
- تم توفير إرشادات لضبط إعدادات الشعاع واكتساب الأطالس.
- تم تحديد الشبكات المناسبة لتقييمات التكبير العالي.
- تم تحديد أهمية العمليات المتكررة في تقييم جودة العينة.
الخلاصات
- التصوير المجهري بالتبريد الإلكتروني هو أداة قوية لعلم الأحياء البنيوي.
- تحضير العينة الصحيح وفحص الشبكة أساسيان للنجاح.
- جمع البيانات عن بعد يعزز سهولة الوصول إلى مرافق التصوير المجهري بالتبريد الإلكتروني.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Cryo-electron microscopy enables high-resolution structural determination of macromolecular targets, supporting target validation and mechanistic de-risking in early drug discovery. The technique provides predictive confidence by revealing structural details of disease-relevant proteins, including membrane complexes and viral antigens, which are often intractable to other methods. Remote operation capabilities enhance accessibility and throughput in shared structural biology core facilities, accelerating hit-to-lead timelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by resolving 3D structures of target proteins and complexes.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct visualization of target conformation and ligand-binding sites.
- Predictive Value: Facilitates structure-based drug design and lead optimization by providing atomic-level insights into target dynamics.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated structural models that serve as references for assay development and screening campaign design.
- Operational Value: Enables standardization of target constructs through structural feedback on expression, purification, and complex formation.
- Scalability: Supports panel screening of target variants or mutants to assess structural integrity and druggability.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Provides structural basis for biomarker alignment by identifying epitopes, allosteric sites, or conformational states relevant to disease.
- Preclinical De-risking: Informs safety assessment by revealing off-target binding mechanisms or structural similarities to human proteins.
- Mechanistic Insight: Clarifies mechanism of action for biologics or small molecules through visualization of bound states.
Pipeline & Workflow Integration
Cryo-EM fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization to preclinical candidate selection, particularly for structurally challenging targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving structures of native complexes and transient states.
- Screening: Enables assay readiness by providing structural feedback on target quality and stability for downstream screening applications.
- Analytics: Delivers quantitative structural metrics such as resolution, map quality, and ligand occupancy that inform go/no-go decisions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by enabling structure-based prediction of pharmacokinetic and pharmacodynamic properties.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable structural platform across multiple targets and projects within a portfolio.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing structural ambiguity.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized grid screening and data collection protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early failure of structurally unsound targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on structural feasibility and druggability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in structural biology, sample preparation, and cryo-EM data processing.
- Dependent on access to high-end cryo-EM microscopes and stable power, cooling, and vibration isolation infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization between protein production, purification, and imaging groups for consistent sample quality.
- Involves adaptation across diverse sample types including detergents, lipids, and nucleic acids that affect ice quality and particle distribution.
- Limited by sample quantity, stability, and homogeneity, which directly impact grid screening success and data usability.
