الحقن المجهري لنطاط الذرة ، Peregrinus maidis ، الأجنة لتحرير جينوم CRISPR / Cas9

حتى الآن ، تم استخدام كريسبر فقط في عدد قليل من Hemipterans. يمكن أن يساعد البروتوكول الموضح هنا الباحثين على تطبيق كريسبر وتحويل الخط الجرثومي في أنواع Hemipteran الأخرى. تم تطوير هذا البروتوكول خصيصا لأجنة الحشرات الحساسة للجفاف.

يمكن للعديد من الخطوات في البروتوكول تحسين النتائج في أنواع الحشرات الأخرى. إن القدرة على توليد نطاطات نباتية محورة وراثيا تفتح الباب أمام طرق مكافحة جديدة ، مثل إنشاء حشرات لم تعد قادرة على نقل الفيروسات. ستكون هذه التقنية ثورية لدراسة وظيفة الجينات في الآفات الأخرى ، مثل تريبس الزهرة الغربية.

لقد قمنا بتكييف تقنية كريسبر هذه لأجنة تريبس مع نتائج واعدة. نجد أن الممارسة في هذا النظام ضرورية للنجاح. يجب أن تسمح الطرق الموضحة هنا ، عند تنفيذها بشكل روتيني ، بالاستخدام المرن في مجموعة متنوعة من الإعدادات.

لإنشاء غرفة لعقد حشرات Peregrinus maidis البالغة ، قم بقطع ثقب في قاع كوب سعة أونصة واحدة وألصق شاشة فوق الفتحة لتبادل الهواء. لاختيار الحشرات البالغة من العمر أسبوعا واحدا ، قم باستنشاق المستعمرة في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر لمدة ساعة واحدة ، قبل تبريد الحشرات لفترة وجيزة على الجليد. تحديد الإناث من خلال وجود ovipositor ، والتي عادة ما تكون أغمق من بقية البطن ، على الجانب البطني من البطن.

نقل الإناث إلى الكأس كما يتم جمعها. عندما يتم اختيار 15 أنثى ، أغلق الكوب بقطعة خمسة × خمسة سنتيمترات من فيلم شمع البارافين. ضع 400 ميكرولتر من محلول السكروز بنسبة 10٪ على الجزء العلوي من الفيلم ، وضع قطعة ثانية من الفيلم خمسة في خمسة سنتيمترات فوق المحلول.

ضع الغرفة البالغة على طبق جمع البيض مع جانب فيلم شمع البارافين البلاستيكي في اتصال مباشر مع وسط وضع البيض ، ولف غرفة وضع البيض بأكملها بغلاف بلاستيكي دون تغطية فتحات الهواء. ثم ضع الغرفة عند 25 درجة مئوية مع رطوبة 70٪ وضوء 14 ساعة ودورة مظلمة لمدة 10 ساعات. لجمع الأجنة ، بعد فترة وضع البويضة المرغوبة ، ضعي شريطا واحدا × 15 ملم من الشريط على الوجهين على زلة غطاء مقاس 22 × 30 مم وضع الغطاء على وسط وضع البيض في غرفة وضع البيض.

باستخدام فرشاة دقيقة ومجهر تشريح ، انقل الأجنة الفردية شبه الشفافة من سطح أجار إلى الشريط على الوجهين. عند اختيار حوالي 25 جنينا ، رتب الأجنة على شكل موز على جوانبها بحيث تكون الأطراف الأكبر عالقة على الشريط. للحقن المجهري للأجنة ، أولا ، ضع الغطاء على طبق بتري 100 × 15 ملليلتر مع 1٪ أجار تحت مجهر تشريح داخل غطاء مرطب.

للتحقق من ضغط الحقن ، ضع طرف إبرة حقن الكوارتز في قطرة ماء وابدأ دورة الحقن. بعد التأكد من إعداد الضغط ، عند الاقتراب من الجانب الأيسر من انزلاق الغطاء ، أدخل الإبرة في الطرف الأكبر من جنين واحد. قم بتوصيل محلول الحقن إلى البويضة واسحب الإبرة بسرعة.

عندما يتم حقن كل البيض ، ضع الغطاء على سطح طبق أجار جديد بنسبة 1٪ وضع الطبق في غرفة الرطوبة. بعد ستة أيام ، استخدم الماء النظيف والفرشاة الدقيقة لنقل أي أجنة على قيد الحياة إلى طبق بتري 35 × 10 ملم يحتوي على ورق ترشيح مبلل بالماء. ختم طبق بتري مع فيلم شمع البارافين البلاستيك ووضع غرفة الفقس في حاضنة 25 درجة مئوية.

بعد ستة إلى ثمانية أيام ، استخدم فرشاة دقيقة لنقل أي حوريات ناشئة من النجوم الأولى إلى طبق بتري من قصاصات الأوراق وأغلق الطبق بغشاء شمع البارافين البلاستيكي. بعد 48 ساعة عند 25 درجة مئوية ، استخدم فرشاة دقيقة لنقل جميع الحوريات البالغة من العمر يومين إلى قفص تربية مع نباتات الذرة. إذا تم استرداد الحقن ذات النمط الظاهري المرئي بأعداد كافية ، فقم بقفص هذه الحشرات بشكل منفصل لتحقيق أقصى قدر من استعادة السمة المستهدفة في الجيل التالي.

قم بتربية الحشرات تحت ظروف درجة الحرارة والرطوبة المناسبة مع عمليات نقل منتظمة إلى نباتات الذرة الطازجة حسب الضرورة ، وفحص النسل بانتظام بحثا عن الأنماط الظاهرية المتوقعة ، ووضع الأفراد الذين يظهرون النمط الظاهري المطلوب في أقفاصهم الخاصة لإنشاء خطوط متماثلة الزيجوت. في هذا التحليل التمثيلي ، تم جمع ما مجموعه 6،483 بيضة من إجمالي 645 أنثى في أربعة أسابيع. تبدأ الإناث عادة في وضع البيض بعد يومين وتوفر معظم البيض من أربعة إلى ستة أيام ، مع تباطؤ نشاط وضع البيض بحلول اليوم التاسع.

لا يؤثر حقن Cas9 تسعة على نمو P.maidis ، حيث أن معدلات النمو للأجنة المعالجة بمحلول الحقن ، ومحلول الحقن المكمل ب Cas9 ، ومحلول الحقن المكمل ب Cas9 وثلاثة RNAs إرشادية ، متشابهة. معدلات الفتحة للمخزن المؤقت وأدوات التحكم Cas9 متشابهة أيضا. ومع ذلك ، فإن معدلات الفقس للأفراد الذين يتلقون مزيج الأدلة الثلاثة عادة ما تكون أقل نسبيا.

في هذه التجربة التمثيلية ، من بين 71 فردا تم حقنهم بالدليل الذين تطوروا ، أظهر 23 درجة معينة من فقدان الصباغ وتسعة فقس ، مما أدى إلى معدل خروج المغلوب يبلغ حوالي 30٪ من المتوقع أن يزيل المزيج ثلاثي الأدلة ما يقرب من 180 زوجا أساسيا من الموضع الأبيض ، كما لوحظ في منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل المضخمة من الحمض النووي الجينومي المعزول من الأفراد المحقونين ، وكذلك في بيانات التسلسل المرتبطة الناتجة عن تلك المنتجات. نوصي باستخدام الإبر المشطوفة لتقليل صدمة الحقن. إذا بدا أن الأجنة تتسرب بعد الحقن ، فافحص أطراف الإبرة للحصول على نتائج أفضل.

الممارسة المستمرة ستزيد من بقاء الجنين. حتى الآن ، لا توجد منشورات تصف تحول الخط الجرثومي في Hemipterans. ومع ذلك ، فقد استخدمنا هذا البروتوكول لصنع نطاطات النباتات المعبرة عن Cas9.

بشكل عام ، فإن القدرة على إجراء تحول الخط الجرثومي في Hemipterans تفتح الباب أمام مجموعة واسعة من استراتيجيات إدارة الآفات الوراثية ، وبالتالي تقليل استخدام المبيدات الحشرية.