عزل خلايا الصمام الخلالي الماوس لدراسة تكلس الصمام الأبهري في المختبر
مايو 10, 2021
توضح هذه المقالة عزل خلايا الصمام الأبهري للفأرة بواسطة إجراء كولاجيناز من خطوتين. خلايا صمام الماوس المعزولة مهمة لإجراء فحوصات مختلفة، مثل هذا المقايسة تكلس المختبر، والتحقيق في المسارات الجزيئية المؤدية إلى تمعدن الصمام الأبهري.
استخدام خلايا صمام الماوس معزولة أمر ضروري للتحقيق في مسار الإشارات المؤدية إلى تكلس صمام في استخدام الخلايا المعدلة وراثيا من الفئران المعدلة وراثيا. الهضم من خطوتين هو طريقة سريعة وفعالة. الجزء الأكثر تحديا من هذا البروتوكول هو عزل الصمام الأبهري من الفئران ثمانية أسابيع.
فمن الأفضل لممارسة على الفئران الأكبر سنا لتصور الصمام الأبهري بشكل أفضل. قبل البدء في التجربة، تنظيف وتعقيم جميع الأدوات الجراحية ومساحة العمل مع 70٪ الإيثانول وautclave الأدوات الجراحية لمدة 30 دقيقة. عندما يكون الإعداد الأولي جاهزا، ابدأ بتنظيف منطقة الصدر والبطن من فأرة القتل الرحيم التي يبلغ عمرها ثمانية أسابيع باستخدام الإيثانول.
باستخدام مقص، افتح البطن وصدر الفأرة، ثم قطع بين الأذين الأيسر والبطين الأيسر مع مقص الجراحية الصغيرة. إزالة الدم من القلب عن طريق غرس 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني الباردة وقطع القلب، والحفاظ على ثلاثة ملليمترات من الشريان الأورطي الصاعد. تحت منظار مجسم، قم بتشريح الصمام الأبهري عن طريق قطع القلب أفقيا في منتصف البطينين وقطع البطين الأيسر نحو الشريان الأبهري، ثم تشريح الصمام الأبهري بعناية.
تجمع الصمامات معا في طبق صغير 35 ملليمتر زراعة الأنسجة. اغسل الصمامات المعزولة في طبق ثقافة الخلايا 75 ملليلتر مع خمسة ملليلترات من HEPES الباردة الطازجة 10 ملليمولار تكملها المضادات الحيوية واحتضانها في خمسة ملليلترات من نوع الكولاجيناز واحد لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز مستمر. بعد الحضانة، طرد المركزي أنبوب لمدة خمس دقائق، في 150 مرة G وغسل بيليه مرة واحدة مع اثنين من ملليلتر من HEPES 10 ملليمولار مع دوامة بسرعة عالية لمدة 30 ثانية.
جمع تعليق الناتجة من الأنبوب إلى طبق ثقافة 35 ملليمتر واستخدام ملاقط رقيقة لنقل بعناية شظايا الأنسجة في أنبوب جديد. ثم احتضان بيليه في أنبوب 15 ملليلتر مع خمسة ملليلتر من نوع الكولاجيناز واحد في 37 درجة مئوية تحت التحريض المستمر لمدة 35 دقيقة. فصل الخلايا عن طريق إعادة تعليق مع ماصة ملليلتر واحد والطرد المركزي في 150 مرة G لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية.
تنظيف الخلايا مرتين عن طريق إعادة تعليق بيليه فصل في اثنين من ملليلتر من DMEM كاملة والطرد المركزي في 150 مرة G لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية. للطلاء، resuspend بيليه في ملليلتر واحد من المتوسطة كاملة وإضافته إلى بئر واحد من ستة طبق ثقافة الخلايا جيدا في الحد الأدنى من المتوسطة. الحفاظ على لوحات دون عائق في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
بعد ثلاثة أيام من الحضانة ، تأكد من النمو بالقرب من حطام الأنسجة من خلال مراقبة الخلايا تحت المجهر. مرة واحدة 1, 000 الخلايا مرئية, إزالة بعناية حطام الأنسجة مع ملاقط autoclaved وتغيير المتوسطة. جرب الخلايا بعد الوصول إلى التقاء 70٪ ونقلها إلى طبق زراعة الأنسجة 75 ملليلتر.
قبل البدء في الفحص، قم بتنظيف غطاء السلامة البيولوجية باستخدام الإيثانول بنسبة 70٪، ودفئ متوسط DMEM إلى 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، البذور 100،000 خلية لكل حالة في ست لوحات بئر في DMEM كاملة والثقافة في 37 درجة مئوية. بعد 24 ساعة، استبدل الوسط الفائق بالمتوسط المتكلس واحتضن الخلايا لمدة سبعة أيام عند 37 درجة مئوية، ليحل محل الوسط في اليوم الثالث.
بعد سبعة أيام، قم بقياس تركيز الكالسيوم في لوحة بئر 96 باستخدام كاشف أرسينازو الثالث وتسجيل الامتصاص عند 650 نانومتر. في التحليل التمثيلي ، تم تحديد الأنماط الظاهرية المختلفة لخلايا الصمام مع تلطيخ المناعة بعد ثلاثة إلى خمسة أيام من الثقافة. الماوس VIC أعرب vimentin وألفا SMA، علامات هامة من خلايا صمام.
بالإضافة إلى ذلك، تحققت تلطيخات المناعة CD31 من عدم وجود تلوث من الخلايا البطانية في ثقافة مركز فيينا الدولي. زراعة مركز فيينا الدولي مع الفوسفات الغنية تكلس المتوسطة تحفيز تكلس في الخلايا، وأكد كذلك مع تلطيخ إيجابية حمراء لعقد الكالسيوم. ويستند البروتوكول على مجموعة من ثلاثة إلى خمسة صمام من الفئران المختلفة.
ومن المهم استخدام رفيقة القمامة وثلاث نسخ بيولوجية مختلفة للتحقق من صحة النتائج. استخدام خلايا صمام الماوس أمر حيوي لفهم المسار الجزيئي المؤدي إلى تضيق الأبهر عن طريق عزل الخلايا من الفئران المعدلة وراثيا. وقد استخدم هذا البروتوكول سابقا للتحقيق في الآثار المترتبة على المسار إلى مستقبلات في الانحدار المعدني للصمام الأبهري المتكلس.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
توضح هذه المقالة إجراءً مكوّنًا من خطوتين باستخدام الكولاجيناز لفصل خلايا صمام الشريان الأورطي للفأر، وهو أمر أساسي لدراسة المسارات الجزيئية المشاركة في تكلسات صمام الشريان الأورطي. تُمكّن طريقة العزل من إجراء اختبارات لاحقة لتقييم تمعدن الصمام.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال البحث
- بيولوجيا الخلية
- مسارات الإشارات
- تكلس الصمام الأورطي
الخلفية
- أهمية خلايا الصمام المعزولة في فهم آليات التكلسات.
- التحديات المرتبطة بفصل صمامات الشريان الأورطي من الفئران البالغة ثمانية أسابيع.
- أهمية نماذج الفئران المعدلة وراثيًا في الكشف عن المسارات الجزيئية.
الطرق المستخدمة
- هضم الكولاجيناز على مرحلتين لفصل الخلايا.
- نموذج الفأر، تحديدًا صمامات الشريان الأورطي من الفئران المعدلة وراثيًا.
- اختبارات in vitro، بما في ذلك قياس تركيز الكالسيوم باستخدام كاشف Arsenazo III.
النتائج الرئيسية
- العزل والثقافة الناجحة لخلايا الصمام.
- تحديد نُوَي خلايا الصمام عن طريق التلوين المناعي الفلوري.
- التحقق من النتائج من خلال عدة نسخ بيولوجية.
الخلاصات
- تقدم هذه الدراسة طريقة فعالة لعزل خلايا صمام الشريان الأورطي، مما يعزز فهم الآليات الجزيئية في تضيّق الشريان الأورطي.
- تسهم النتائج في البحث البيولوجي الأوسع حول تكلسات صمامات القلب.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Reliable isolation and characterization of mouse valve interstitial cells (VICs) enables mechanistic interrogation of aortic valve calcification, a key driver of aortic stenosis. This workflow supports early discovery and target validation by providing a disease-relevant in vitro system for pathway analysis and pharmacological testing. The method enhances predictive confidence for translational research and portfolio triage in cardiovascular drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic de-risking by isolating VICs for pathway interrogation in calcification.
- Supports functional target validation using genetically modified mouse models.
- Facilitates hypothesis-driven testing of molecular drivers and inhibitors of mineralization.
- Provides a platform for evaluating new pharmacological targets in a controlled system.
Screening & Assay Development
- Delivers validated primary cell cultures for reproducible in vitro calcification assays.
- Standardizes cell phenotype confirmation via immunofluorescence for assay reliability.
- Enables quantitative measurement of calcification using calcium reagent and alizarin red staining.
- Prepares scalable systems for compound screening and comparative analysis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with disease-relevant mechanisms observed in aortic stenosis.
- Supports continuity from genetic models to preclinical validation of therapeutic hypotheses.
- Provides a platform for biomarker discovery and mechanistic studies in valve pathology.
- Reduces translational risk by modeling human disease processes in primary mouse cells.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical target validation in cardiovascular research.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification in valve calcification.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for compound evaluation.
- Analytics: Supports statistical comparison of calcification across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro mechanistic insights to in vivo disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for diverse genetic backgrounds and pharmacological studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes cell isolation and assay protocols for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation in early-stage cardiovascular programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and compounds for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse dissection and primary cell culture techniques.
- Needs access to sterile surgical instruments, biosafety hoods, and analytical reagents.
- Demands rigorous cross-team standardization for cell isolation and phenotype validation.
- Adaptable to various transgenic mouse models for pathway-specific studies.
- Dependent on careful dissection and pooling of valves to ensure sufficient cell yield and reproducibility.
