باستخدام صبغة الفلورسنت، رودامين B، لدراسة القدرة التنافسية التزاوج في الذكور Aedes aegypti البعوض
مايو 7, 2021
هنا، نقدم بروتوكولا لدراسة القدرة التنافسية التزاوج من الذكور Aedes aegypti باستخدام صبغة الفلورسنت كعلامة. وتتعرض البعوض الإناث للذكور على حد سواء ملحوظ وغير ملحوظ لcopulation. بعد التزاوج ، يتم فحص الحيوانات المنوية تحت المجهر الفلوري لتحديد شريكهم في التزاوج.
يقيس هذا البروتوكول القدرة التنافسية لتزاوج البعوض الذكوري، وهو شرط أساسي لبرامج قمع البعوض القائمة على إطلاق البعوض. يتم تقييم معيار اللياقة البدنية هذا كجزء من مراقبة الجودة وتقييم الإجهاد. تقلل هذه الطريقة من الوقت التجريبي بنسبة 90٪ وتسمح بالمقارنة المباشرة بين القدرة التنافسية للتزاوج بين خطين عقيمين أو مصابين ب Wolbachia.
تنفيذ هذا الإجراء سيكون ايرين لي وكينغ واي ماك. للبدء ، مارس الجنس مع البعوض الذكور والإناث في مرحلة الجرو ، وفقا لاختلافات حجمها. لكل مجموعة من البعوض، نقل 100 من الخوادر الذكور إلى قفص المسمى مسبقا لتغذية السكروز أو رودامين B السكروز التغذية.
ضع الخوادر الأنثوية في دفعات صغيرة من 40 إلى 50 لكل قفص. عند ظهور imagos ، تحقق من الأقفاص بحثا عن وجود البعوض الذكور. لإعداد محلول السكروز 0.2٪ رودامين B، حل 200 ملليغرام من مسحوق رودامين B لكل 100 ملليلتر من محلول السكروز 10٪.
تخلط جيدا لضمان أن يتم حل جميع مسحوق. إعداد 20 زجاجة تغذية السكر مع الفتيل. إضافة 10 ملليلتر من السكروز 10٪ إلى 10 زجاجات التغذية و 10 ملليلتر من محلول السكروز 0.2٪ رودامين B للزجاجات المغذية الأخرى 10.
ضع خمس زجاجات مغذية في كل قفص ذكر معد والسماح للبعوض الذكر بالتغذية لمدة ثلاثة أيام قبل تجربة التزاوج. قم بتشغيل مصباح موقد الزئبق والمجهر الاستريو. السماح لمصدر الضوء إلى مصباح الزئبق الموقد لتحقيق الاستقرار لمدة 10 دقائق.
ثم تعيين مرشحات الفلورية للبروتين الفلوري الأحمر واحد. يستنشق عددا صغيرا من البعوض في وقت واحد في الأنبوب الزجاجي للطامحين الفمويين. من خلال الأنبوب الزجاجي ، لاحظ جسم البعوض الذكر تحت المجهر الاستريو الفلوري.
استخدم البعوض الذكور فقط مع رودامين B للتجربة. نقل تعيين البعوض الذكور في 12 أكواب ورقية المضمون مع المعاوضة. وضع 10 السكروز تغذية البعوض الذكور لكل كوب في ستة أكواب، و 10 رودامين B السكروز تغذية البعوض الذكور لكل كوب في الكؤوس الستة الأخرى.
كرر هذه الخطوة لتعيين البعوض الذكور B. إعداد 12 أقفاص للتزاوج. في كل من الأقفاص الستة ، وتشمل 10 مجموعة البعوض الذكور التي هي رودامين باء ملحوظ ، 10 غير ملحوظ مجموعة بعوض الذكور باء ، و 10 البعوض الإناث البرية البكر من نوع.
في الأقفاص الستة الأخرى ، تشمل 10 مجموعة غير معلمة بعوض ذكر ، و 10 رودامين B علامة على مجموعة بعوض ذكر B ، و 10 بعوضة أنثى برية عذراء. تسمية هذه الأقفاص للتمييز بوضوح بين الجمع بين اثنين من التزاوج. ضع أكواب الذكور في أقفاص التزاوج وفقا للتسميات.
إزالة المعاوضة والاستفادة بلطف من الكأس لتزاحم الذكور للخروج من الكأس. قم بإزالة الكوب الورقي والمعاوضة بعناية من القفص لضمان عدم هروب البعوض من القفص. السماح للبعوض الذكور بالتأقلم في قفص التزاوج لمدة ساعة على الأقل.
باستخدام جهاز التنفس الفموي ، قم بنقل البعوض الأنثوي البري البكر إلى 12 كوبا ورقيا ، يحتوي كل كوب على 10 بعوضة. بعد فترة التأقلم للبعوض الذكور ، نقل كوب واحد من الإناث في كل قفص التزاوج وإزالة المعاوضة. تزاحم بلطف الكأس لتشجيع أي البعوض الإناث المتبقية للخروج من الكأس، ثم إزالة بعناية الكأس الورقية والمعاوضة من القفص لضمان عدم هروب البعوض من القفص.
السماح للتزاوج أن يحدث لمدة ثلاث ساعات، ومن ثم إنهاء تجربة التزاوج عن طريق إزالة جميع البعوض من كل قفص مع الطامح الميكانيكية. تخدير البعوض البارد على الجليد لمدة خمس دقائق على الأقل. عندما يتم تخدير البعوض بالكامل ، التقط البعوض الأنثوي برفق واؤوه في كوب ورقي منفصل مؤمن بالمعاوضة.
تسمية كوب ورقة عن طريق نقل التسمية المعنية من قفص التزاوج على الكأس. لتسجيل الحيوانات المنوية الأنثوية ، تخدير البعوض الأنثوي على الجليد لمدة خمس دقائق على الأقل قبل تشريحه تحت مجهر ستيريو. تشريح البعوض الإناث تحت المجهر ستيريو.
فحص الحيوانات المنوية تحت المجهر. إذا لم يتم تلقيح الأنثى ، فإن جميع الحيوانات المنوية الثلاثة ستكون فارغة ، وإذا تم تلقيحها ، سيتم ملء اثنين أو ثلاثة من الحيوانات المنوية بالحيوانات المنوية المتحركة. بالنسبة للأفراد الذين تم تلقيحهم، حدد ما إذا كانت الحيوانات المنوية تحتوي على رودامين B تميز السائل المنوي من خلال فحصها تحت المجهر ستيريو الفلورسنت مجهزة مرشح RFP1.
إذا تم تعبئة الحيوانات المنوية مع السائل المنوي الذي لم يتم وضع علامة مع رودامين B، لا يلاحظ مضان. من ناحية أخرى، إذا كان spermatheca يحتوي على رودامين B ملحوظ السائل المنوي، فإنه فلورسي البرتقال. وكان الهدف من هذا الفحص القدرة التنافسية التزاوج لتحديد ما إذا كان يمكن أن يكون هناك خسارة في اللياقة البدنية التزاوج الذكور بعد عدة أجيال من التزاوج.
وأجريت ثلاث نسخ تجريبية من اختبار القدرة التنافسية للتزاوج، وتظهر بيانات التلقيح هنا. تم تلقيح الإناث البرية من قبل الذكور الأصيلين أو المتقاطعين ، مع وضع علامات متبادلة. وتبين النتائج أن نسبة الإناث اللاتي تلقيحهن الذكور الأصيلات أو اللائي تجاوزنها لم تتأثر بوسم رودامين باء.
وتزاوجت نسبة أعلى بكثير من الإناث مع الذكور المتقاطعة مقارنة بالذكور الأصيلين في جميع النسخ المتماثلة الثلاثة، مما يشير إلى أن التزاوج الداخلي يمكن أن يؤدي إلى فقدان اللياقة البدنية للتزاوج. من المهم إعداد أقفاص إضافية من البعوض الأنثوي. لا تستخدم البعوض الأنثوي من قفص ملوث بالبعوض الذكور ، لأن الإناث قبل تلقيحه سيجعل جميع البيانات غير صالحة.
بخلاف اختبار القدرة التنافسية للتزاوج القائم على المختبرات ، يمكن استخدام هذا الإجراء في تجارب استعادة العلامات لدراسة بيولوجيا تزاوج الحشرات ، وديناميات السكان ، وتشتتها.
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة بروتوكولًا لتقييم قدرة التزاوج التنافسية في ذكور بعوضة Aedes aegypti، وهو اعتبار مهم في استراتيجيات التحكم في تعداد البعوض. باستخدام الرودامين ب كمادة مضيئة، يمكن للباحثين مقارنة مباشرة نجاح التزاوج للذكور المميزة مقابل الذكور غير المميزة بعد التعرض للإناث من البعوض.
مكونات الدراسة الرئيسية
منطقة البحث
- قدرة التزاوج التنافسية للبعوض
- استراتيجيات قمع تعداد البعوض
- سلوك الحشرات وعلم الأحياء
الخلفية
- الحاجة إلى فعالية التحكم في تعداد البعوض بسبب دورها في انتقال الأمراض.
- أهمية تقييم لياقة التزاوج للذكور لمراقبة الجودة في برامج التقنية الحشرية المعقمة.
- استخدام العلامات المتوهجة لتعزيز دقة التجربة وكفاءتها.
الطرق المستخدمة
- اختبارات تزاوج خاضعة للرقابة باستخدام ذكور البعوض المميزة وغير المميزة.
- Aedes aegypti ككائن نموذجي.
- المجهر الفلوري لتحليل نتائج التزاوج ووجود الحيوانات المنوية.
النتائج الرئيسية
- التزاوج الداخلي يقلل من لياقة التزاوج للذكور، كما يتضح من انخفاض معدلات التلقيح في الذكور المتزاوجة داخليًا مقارنة بالذكور المتزاوجة خارجيًا.
- لم يؤثر العلامة الفلورية على نسبة الإناث الملقحة.
- تتيح الطريقة الفعالة تقييمًا سريعًا لقدرة التزاوج التنافسية.
الاستنتاجات
- تسلط هذه الدراسة الضوء على تأثير العوامل الوراثية على نجاح التزاوج في Aedes aegypti.
- النتائج ذات صلة للأبحاث المستقبلية في التحكم في البعوض وديناميكيات تعداد البعوض.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Assessing male mating competitiveness is critical for evaluating strain fitness in sterile insect technique programs, directly impacting the success of vector control strategies. This fluorescent dye-based method enables rapid, quantitative comparison of mating fitness between strains, reducing experimental time by 90% and supporting data-driven go/no-go decisions in pipeline advancement. By providing a scalable, reproducible assay for target validation in vector-borne disease intervention, it enhances predictive confidence in preclinical strain selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct interrogation of mating fitness as a phenotypic endpoint for strain fitness evaluation.
- Operational Value: Reduces assay duration from days to hours by eliminating blood-feeding and egg-hatching steps.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by quantifying competitive mating success between sterile or Wolbachia-infected lines.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, fluorescence-based readouts for mating partner identification in spermathecae.
- Operational Value: Uses sucrose feeding for non-invasive male marking, enabling high-throughput preparation of labeled cohorts.
- Reproducibility: Standardized Rhodamine B concentration (0.2% in 10% sucrose) ensures consistent labeling across experimental replicates.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges laboratory strain evaluation to field release readiness by assessing a key fitness criterion for population suppression.
- Mechanistic De-risking: Detects fitness costs of inbreeding through reduced insemination rates, informing strain maintenance strategies.
- Disease-Relevant System: Uses Aedes aegypti, a vector for dengue, Zika, and chikungunya, aligning with global health priorities.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting strain selection after genetic modification and before field trial planning, by providing a quantitative mating competitiveness metric.
- Discovery Biology: Tests the hypothesis that genetic background influences mating success through competitive male-female interactions.
- Screening: Produces standardized, fluorescent sperm labeling enabling blind scoring of mating outcomes across experimental groups.
- Analytics: Generates proportional insemination data per male strain, facilitating statistical comparison of mating fitness.
- Translational Research: Connects laboratory competitiveness to field efficacy by validating a prerequisite for sterile male release success.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for comparing any two male strains, applicable across vector control programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into mating fitness determinants, reducing ambiguity in strain selection.
- Operational Value: Eliminates dependency on blood feeding and embryology, simplifying workflow and increasing throughput.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying fitness defects early, reducing investment in non-competitive strains.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of strains based on validated mating competitiveness data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mosquito handling, sex separation at pupal stage, and fluorescence microscopy.
- Necessitates stereo microscope with RFP1 filter set and mercury burner lamp for standardized fluorescence detection.
- Demands cross-team standardization of male marking protocols and female dissection procedures to ensure data consistency.
- Involves adaptation considerations when applying to different mosquito species or strains with varying feeding behaviors.
- Includes practical limitations such as the need to avoid pre-inseminated females and ensure proper cage labeling to prevent cross-contamination.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:41
Preparation of Male and Female Mosquitoes
1:11
Preparation of 0.2% RhB Sucrose Solution and Feeding of Male Mosquitoes
1:52
Checking for RhB Fluorescence in Male Mosquitoes
2:46
Mating Competitiveness Assay
5:36
Results: Assessment of Mating Competitiveness in Male Mosquitoes
6:27
Conclusion
