فحص الببتيدات التي تنشط MRGPRX2 باستخدام خلايا HEK المهندسة

اليوم، سوف نظهر طريقة لفحص مكتبة الببتيد، ضد مستقبلات رئيسية اكتشفت مؤخرا، وهو مستقبلات البروتين G ذات الصلة ماس X2، والمعروف أيضا باسم مستقبلات MRGPRX2. الخلايا الصاري هي جزء لا يتجزأ من الجهاز المناعي، وتلعب دورا حاسما في كل من الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية. يتم تنشيط الخلايا الصاري إما عن طريق مستقبلات Fc epsilon R1 المقيدة بالمستضد ، أو من قبل مستقبلات X2 المكتشفة مؤخرا.

تنشيط مستقبلات X2 السطح ملزمة، وقد تم ربط لعدة أمراض مناعية، وملتهبة، وبالتالي، من المهم أن نفهم آلية ملزمة لهذا المستقبلات إلى ليغاندس لها. للقيام بذلك ، قمنا بتطوير مكتبة من جزيئات الببتيد الصغيرة ، وفحصناها ضد مستقبلات X2 التي تم التعبير عنها بشكل مفرط على hexis. في الدراسة، تم بناء مكتبة الببتيد باستخدام تقنيات بسيطة ومتعددة الاستخدامات لمسح ألانين، واقتطاعات الأحماض الأمينية.

Heck293 يقول ، والتعبير عن مستقبلات X2 عند تفعيلها مع الببتيدات و hexis واسعة من نوع استخدمت السيطرة. في إصدار اقتطاع عند التنشيط تم رصد لدراسة التنشيط X2 المستندة. تجريبيا، Fura-2 AM صبغ الكالسيوم الحساسة متحمس في 340 و 380 نانومتر، في حين يتم تسجيل الانبعاثات في 510 نانومتر.

عند ربط الكالسيوم ، تزداد كثافة الفلورسينس عند 340 ، في حين أن 380 نانومتر ، تنخفض. ثم تترسب الصبغة بنسبة كثافة الفلورسينس عند 340، إلى 380 نانومتر. يمكن حساب 340 من نسبة 380 ، يتناسب مع الكالسيوم داخل الخلايا ، وقيمته ، من خلال معادلة Grynkiewicz.

يتم الكشف عن نسبة التبويب من اثنين من كثافة الفلورية، وتأثير العوامل التجريبية مثل التخفيف، photobleaching، تسرب صبغ، وكثافات رائحة. لذا، دون مزيد من التأخير، دعونا نبدأ التجربة. لتحديد ligands من مستقبلات الخلية الصاري MRGPR X2، مولد N-اقتطاع، C-اقتطاع، وN + C-مبتورة مكتبة الببتيد، عن طريق اقتطاع N-الطرفية، C-المحطة الطرفية، والأحماض الأمينية N + C-المحطة الطرفية من سوءproctivity بام-12.

استخدام توليف الببتيد المرحلة الصلبة لتجميع الببتيدات. تعديل محطة النهاية إلى مجموعة المد والجزر مجموعة، وC-محطة إلى مجموعة أميد. توليد ويمكن أن ألانين مكتبة الببتيد، عن طريق استبدال الأحماض الأمينية الخاصة بام-12 من قبل ألانين، واحد في وقت واحد.

تعديل المحطة الطرفية النهائية إلى مجموعة setide و C-terminal إلى مجموعة وسط. إعداد الثقافة المتوسطة عن طريق استكمال DMEM الجلوكوز عالية، مع 10٪ مصل البقر الجنين، واثنين من الميليمولار L-الجلوتامين، مائة وحدة لكل مل من البنسلين، ومائة ميكروغرام، لكل مل من العقدية. إلى جانب الخلايا في تي سو الثقافة سمة، 375 قارورة الثقافة في 37 درجة مئوية، 5٪CO2، سمسم هم 75 إلى 80٪التقاء.

مرة واحدة 75٪ التقاء، وغسل الخلايا وإضافة اثنين إلى ثلاثة مل من بروف-C، لفصل الخلايا. بمجرد انفصال الخلايا، اجمع الخلايا في Proof-C. إضافة ستة إلى تسعة مل المتوسطة الطازجة.

الطرد المركزي الخلايا في 1620g لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. بعد الطرد المركزي، والتخلص من supernatant لجمع بيليه. إعادة إنفاق الخلايا في وسط الثقافة الطازجة.

تمييع الخلايا، وفقا للتركيز المطلوب. في 200 ميكرولتر من تعليق الخلية مع تركيز 200، 000 خلية، صب الأمبون في كل بئر للبحث عن 40،000 خلية لكل بئر. حراسة الخلايا لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية، 5٪ حاضنة CO2.

استخدام Fura-2 AM صبغة للتجربة. إضافة 50 ميكرولتر DMSO في 50 ميكروغرام Fura-2 AM، لإعداد حل واحد صارخ ملليمولار من صبغ Fura-2 AM. إضافة ميكرولتر واحد من صبغة واحدة ملليمولار Fura-2 AM لكل مل من المتوسطة الطازجة لإعداد المتوسط المخفف لتركيز صبغة ميكرومولار واحدة.

إزالة لوحة 96 جيدا من الحاضنة وتجاهل المتوسطة. استبدال المتوسطة مع متوسطة مخففة جديدة. إضافة 200 ميكرولتر من المتوسطة المخفف في كل بئر.

احتضان الخلايا لمدة 30-40 دقيقة في 37 درجة مئوية، حاضنة 5٪CO2. في حين يتم احتضان الخلايا، تعيين قارئ لوحة. تعيين درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية.

في الإعدادات، حدد فليكس. تعيين وضع القراءة إلى فلورسينس وقراءة القاع. في الأطوال الموجية، حدد عدد الأطوال الموجية إلى اثنين.

تعيين الإثارة إلى 340 نانومتر و 380 نانومتر. تعيين الانبعاثات إلى 510 نانومتر. اترك الحساسية إلى الافتراضي.

في التوقيت، قم بتعيين الفاصل الزمني إلى 3.9 ثانية. تعيين وقت التشغيل إلى 94 ثانية للحصول على 25 أرقام القراءات. بعد ذلك، حدد نوع لوحة المقايسة.

بعد ذلك، حدد ويلز للقراءة. في "نقل مركب"، تعيين عمليات النقل إلى واحد، والحجم الأولي إلى مائة ميكرولتر. تعيين ارتفاع ماصة إلى مائة ميكرولتر، وحجم إلى 50 ميكرولتر، ونقطة زمنية إلى 36 ثانية لإضافة المركب، وتميل القراءة.

بعد ذلك، حدد نوع لوحة المصدر المركب. ترك تريتورات لعدم استخدامها. حدد تخطيط تلميحات وتلميحات ماصة.

للأعمدة المركبة والأطراف، سيتم نقل المركب في العمود الأول من لوحة المركب. تعيين عمود تلميح إلى واحد، والعمود المركب إلى عمود واحد. اترك إعادة المعايرة التلقائية إلى On.Click OK. بعد 40 دقيقة من الحضانة، قم بإزالة الوسط.

اغسل الخلايا مع المخزن المؤقت XDB. إضافة مائة ميكرولتر من العازلة XDB للقراءة الفلورية. خذ الطبق للقراءة الفلورية.

عندما تصل درجة البريتشيت إلى 37 درجة مئوية، اضغط على غرفة القراءة، لوضع لوحة المقايسة في قارئ لوحة الفلورسينس. اضغط على المصدر لوضع لوحة المركب. إعداد لوحة مركب بإضافة 200 ميكرولتر من الببتيدات المحترمة أيونوميسين وEGTA لتحويل حلول X.

اضغط على تلميح برات لوضع مربع تلميح. استخدام طرف أسود لتجنب الفلورة التلقائية تلميح. بمجرد الاحتفاظ باللوحات، وإذا كنت تستخدم إعدادات البرنامج واضغط على قراءة.

تحديد تركيز الكالسيوم من نسبة الفلوريس من معادلة غرينكيفيتش. يظهر هو بيانات الفلورية للببتيد بام جيدة. كما يمكن أن نرى، بعد إضافة الببتيد في 36 ثانية، مضان في 340 نانومتر وهذا هو لوكر يزيد من ذلك من 380 نانومتر انخفاض قياسي.

وتمثل البيانات كنسبة 340، إلى 380 إشارة. أنها تظهر من إشارات يزيد بعد إضافة الببتيد. هذا الرقم هو البيانات التمثيلية للببتيد المنشط.

الشكل A يظهر إشارات الفلورسينس لبتيد المنشط. البيانات الممثلة يتوافق مع cram12 تمت إضافة الببتيد بعد إنشاء خط أساس لدورات المناقصة، كما هو مبين في اللغط. ويبين الشكل باء نسبة انبعاث الفلورسينس بعد الإثارة عند 340 نانومتر، إلى نسبة انبعاث الفلورسينس بعد الإثارة عند 380 نانومتر.

هذا الرقم هو بيانات الممثل للفراغ. الشكل أ يظهر إشارات الفلورسينس للفراغ. تمت إضافة HTB بعد تخفيف خط الأساس ل 10 دورات تغذية كما هو موضح في اللغط.

ويبين الشكل باء حصة انبعاث الفلورسينس بعد الإثارة عند 340 نانومترا إلى حصة انبعاث الفلورسينس بعد الإثارة عند 380 نانومتر. هذا الرقم هو بيانات الممثل لمعايير معايرة الصبغة. يظهر الشكل A أنه تمت إضافة الأيونوميسين في القراءات العاشرة، كما هو مبين في اللغط للحصول على أقصى قدر من الفلورسينس في الحالة المقيدة بالكاشيم.

تمت إضافة EGPA Triton X مائة بعد 20 قراءة كما هو مبين من قبل اللغط الذي يحصل على الحد الأدنى من الإشارة. ويبين الشكل باء نسبة انبعاث الفلورسينس بعد الإثارة عند 340 نانومترا إلى نسبة انبعاث الفلورسينس بعد الإثارة عند 380 نانومتر. يتم وضع هذه القيم كذلك في معادلة Grynkiewicz للحصول على ذاكرة التخزين المؤقت داخل الخلايا من التركيز.

يظهر هذا الشكل توصيف الببتيد التمثيلي لتأكيد التسلسل والنقاء. الشكل ألف يظهر الكتلة الرأسية للتسلسل الببتيد ممثل WNK WAL كان 857.90 صبغة رقيقة. والذي يظهر من قبل N على Zed نسبة في التحليل الطيفي الشامل.

الشكل B يظهر نقاء الببتيد من 99٪ كما أكد HPLC. ينتمي هذا الببتيد إلى مكتبة الببتيد N +C المبتورة. في الختام، الطريقة الموصوفة هنا هي طريقة سهلة ومتعددة الاستخدامات والتي يمكن أن تكون فعالة ومشرقة للفحص الأخير القائم على الكالسيوم.

ومع ذلك، هناك العديد من العوامل التي تحدد نوعية البيانات، وبالتالي، يحتاج إلى تحسين ماكياج لنظام أداة الخلية معينة. شكرًا لك.