تحليل البيئة الدقيقة للكبد أثناء التقدم المبكر لسرطان الخلايا الكبدية المرتبط بمرض الكبد غير الكحولي في أسماك الزرد

توفر نماذج وبروتوكول سرطان الكبد الزرد لدينا فرصة فريدة لتصور البيئة الدقيقة للكبد والمشهد المناعي في الجسم الحي ، غير الغازي ، باستخدام المجهر داخل الحيوية. لا شك أن شفافية يرقات الزرد هي الميزة الرئيسية لهذا النظام ، والذي يسمح لنا بإجراء الفحص المجهري داخل الحيوية غير الغازية واكتساب نظرة ثاقبة على البيئة الدقيقة وتسلل الخلايا المناعية للأنسجة العميقة والأعضاء ، مثل الكبد. يمكن بسهولة تطبيق نموذجنا الكلوي الناجم عن النظام الغذائي وتقنيات التصوير الموصوفة في هذا البروتوكول على تفاعلات الخلايا الخلوية المعقدة في أمراض الكبد الأخرى أو مجالات البحث ، بما في ذلك متلازمة التمثيل الغذائي وأمراض القلب والأوعية الدموية.

سيوضح الإجراء كاسيا مايكل ، فني المختبر لدينا ، والدكتور فرانسيسكو خوان مارتينيز نافارو ، زميل ما بعد الدكتوراه في مختبري. للبدء ، قم بوزن أربعة غرامات من النظام الغذائي للأغذية الجافة التجارية ليرقات أسماك الزرد في دورقين زجاجيين سعة 25 ملليلتر ، أحدهما للنظام الغذائي العادي والآخر للنظام الغذائي عالي الكوليسترول بنسبة 10٪ ، أو HCD. يزن 0.4 جرام من الكوليسترول في كوب زجاجي سعة 10 ملليلتر ويغطى الكأس بورق القصدير.

في غطاء الدخان ، قم بقياس خمسة ملليلتر من ثنائي إيثيل الأثير باستخدام حقنة 10 ملليلتر مع إبرة قياس 20. ثم ، أضف ثنائي إيثيل الأثير إلى كوب النظام الغذائي العادي وامزجه على الفور مع الطعام الجاف باستخدام ملعقة. قم بقياس خمسة ملليلترات أخرى من ثنائي إيثيل الأثير باستخدام نفس المحقنة والإبرة وأضفها إلى الكوب الذي يحتوي على HCD.

اخلطي على الفور عن طريق الشفط لأعلى ولأسفل باستخدام المحقنة. أضف محلول الكوليسترول بسرعة إلى كوب HCD واخلطه على الفور مع ملعقة حتى يصبح المحلول موحدا. اترك الأكواب في غطاء المحرك لمدة تصل إلى 24 ساعة لتبخر إيثر ثنائي إيثيل تماما.

في اليوم التالي ، قم بطحن الوجبات الغذائية إلى جزيئات دقيقة باستخدام مدقة وهاون. انقل كل نظام غذائي إلى كيس بلاستيكي صغير يحمل علامة أو أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر وقم بتخزينه عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر. قم بإعداد خطوط الأسماك المعدلة وراثيا في اليوم ناقص واحد.

في اليوم صفر ، اجمع البيض في مصفاة شبكية بعد أن تفرخ الأسماك. باستخدام زجاجة غسيل مع E3 ، اشطف البيض جيدا وانقله بعناية إلى أطباق بتري بطول 10 سم مع وسط E3. تنظيف صفائح جميع الحطام الذي قد يكون تراكم في صناديق التكاثر ، بما في ذلك أي بيض ميت أو غير مخصب لتجنب النمو غير المنضبط للكائنات الحية الدقيقة وما يترتب على ذلك من عيوب في تطور اليرقات.

ثم قسم البيض بكثافة 70 أو 80 بيضة لكل طبق يحتوي على 25 ملليلتر من E3. في اليوم الأول ، تحقق من الأجنة الميتة أو الأجنة التي تعاني من عيوب في النمو وتنظيفها تحت نطاق تشريح مجهز بقاعدة إضاءة. في اليوم الخامس ، امزج اليرقات من جميع الأطباق في طبق بتري بطول 15 سم وأضف E3 بدون أزرق الميثيلين. قسم اليرقات في صناديق التغذية وأطعمها كما هو موضح في مخطوطة النص.

احتفظ باليرقات في غرفة الزرد أو الحاضنة عند 28 درجة مئوية في دورة الضوء الداكن وأطعمها مرتين في اليوم من اليوم 5 إلى اليوم 12. قم بإزالة بقايا الطعام يوميا وكذلك 90 إلى 95٪ من الوسط باستخدام نظام فراغ متصل بطرف ماصة سعة ملليلتر واحد. ثم ، صب بعناية E3 الجديد بدون الميثيلين الأزرق في زاوية واحدة من صندوق التغذية لتجنب إتلاف اليرقات.

بدلا من ذلك ، يمكن تقسيم اليرقات إلى خزانات سعة ثلاثة لترات مع مياه النظام ووضعها كوحدة نظام مستقلة ذات تدفق مياه منخفض. يوفر هذا البديل الوقت اللازم لعملية التنظيف اليومية ، ويساعد نظام الترشيح في الحفاظ على صحة اليرقات حتى نقطة النهاية. في اليوم 13 ، قم بإعداد أطباق التجميع وفقا لعدد الظروف التجريبية التي تم إعدادها.

صب ما يكفي من E3 بدون أزرق الميثيلين لتغطية الجزء السفلي من كل طبق. ثم ، بعناية ، باستخدام نظام الفراغ ، استنشاق الماء من صناديق التغذية. عندما يبدأ مستوى الماء في الانخفاض ، ارفع صندوق التغذية ببطء لجعل اليرقات تسبح إلى أحد الزوايا ، ثم تستنشق في الاتجاه المعاكس.

بمجرد بقاء حوالي 20 إلى 30 ملليلتر فقط من السائل ، قم بصب اليرقات بعناية في طبق Petri المحضر ووضع الشريط المسمى من صندوق التغذية على غطاء الطبق. على المجهر المجسم الفلوري ، قم بفحص اليرقات المخدرة بحثا عن علامات الفلورسنت المطلوبة. ثم أضف تريكاين E3 إلى غرف جهاز الجرح والانحباس.

قم بإزالة فقاعات الهواء من الغرف وقناة التقييد باستخدام ماصة دقيقة P-200. قم بإزالة جميع التريكاين E3 الزائدة ، مع ترك حجم كاف فقط لملء الغرف. بعد ذلك ، انقل يرقات مخدرة إلى غرفة التحميل في جهاز الجرح والانحباس ووضعها لتصوير الفص الأيسر باستخدام أداة رموش.

صورة مورفولوجيا جميع الخلايا المطلوبة في الكبد تحت المجهر البؤري كما هو موضح في مخطوطة النص. افتح برنامج فيجي. ثم افتح ملف الصورة وحدد خيار تقسيم القنوات من علامة التبويب خيارات استيراد التنسيق الحيوي.

بعد إنشاء إسقاطات الكثافة القصوى لكل قناة ، قم بإنشاء عائد استثمار يحيط بالكبد اليرقي وقياس منطقة الكبد. ثم أضف شريط مقياس كمرجع وقم بإنشاء عائد استثمار ثان بما في ذلك منطقة الكبد و 75 ميكرومتر من المنطقة المحيطة. في قائمة المكونات الإضافية ، حدد خيار التحليل متبوعا بعداد الخلايا واحسب الخلايا المناعية داخل منطقة التوظيف.

سجل عدد الخلايا المناعية المعينة في جدول بيانات. احسب كثافة العدلات والبلاعم والخلايا التائية عن طريق تطبيع عدد الخلايا المناعية لكل منطقة كبد. لا تظهر يرقات الزرد HCC التي تتغذى على نظام غذائي طبيعي أي تنكس دهني كبدي ، كما تم قياسه بواسطة تلطيخ Oil Red O.

ومع ذلك ، فإن يرقات HCC التي تتغذى على HCD تظهر زيادة كبيرة في التنكس الدهني الكبدي. بعد ثمانية أيام من التعرض لفائض الكوليسترول ، لوحظ تضخم الكبد في يرقات HCC. لتقييم تضخم الكبد ، تم تقييم منطقة الكبد ومنطقة سطح الكبد وحجم الكبد.

في HCC المرتبط بالتهاب الكبد الدهني غير الكحولي ، تم زيادة منطقة خلايا الكبد ، إلى جانب المنطقة النووية ، ونسبة النووية إلى السيتوبلازم. كما لوحظ انخفاض كبير في الدائرية النووية في مجموعة HCC التي تتغذى على نظام غذائي عالي الدهون. باستخدام علامة H2B-mCherry ، تم الكشف عن حدوث أكبر للنوى الدقيقة في يرقات HCC التي تتغذى على HCD.

أظهر تقييم الأوعية الدموية الكبدية زيادة كبيرة في كثافة الأوعية الدموية في يرقات HCC التي تتغذى على HCD. حدث تسلل البلاعم والعدلات في كل من HCC و HCC التي تتغذى على يرقات HCD. أظهر القياس الكمي للعدلات في البلاعم في الكبد والمناطق المجاورة له زيادة كبيرة في عدد وكثافة الخلايا في يرقات HCC التي تتغذى على HCD.

وعلى النقيض من ذلك، لوحظ انخفاض كبير في كثافة الخلايا التائية في العدد الإجمالي في يرقات HCC التي تتغذى على HCD. يعد تنظيف الخزانات والتغذية من أهم الخطوات لضمان بقاء اليرقات وتجنب تطور التنكس الدهني أو الكبد والالتهاب المزمن الجهازي في الضوابط بسبب سوء نوعية المياه أو التغذية غير السليمة. يمكن إجراء طرق أخرى مثل الفحص المجهري بالفاصل الزمني وتحليل التفاعل بين الخلايا المختلفة التي تملأ الكبد.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إجراء البحث عن الحمض النووي الريبي أحادي الخلية للكبد التشريحي في مراحل سرطان الكبد المختلفة لفهم كيفية تطور المشهد المناعي للكبد بشكل كامل مع تطور المرض.