الجوانب العملية لإعداد عينة والإعداد من 1H R1ρ تجارب التشتت الاسترخاء من الجيش الملكي النيبالي
يوليو 9, 2021
نقدم بروتوكول لقياس ديناميات الصغرى إلى مللي ثانية على 13C /15N المسمى وغير المسمى الجيش الملكي النيبالي مع 1H R1ρ الاسترخاء تشتت الرنين المغناطيسي النووي (NMR) الطيفية. ينصب تركيز هذا البروتوكول على إعداد عينات عالية النقاء وإعداد تجارب NMR.
يصف هذا البروتوكول إعداد عينة الحمض النووي الريبي وإعداد NMR لقياسات تشتت الاسترخاء البروتون R1rho لفحص التبادل التأكيدي في جزيئات الحمض النووي الريبي. وبما أن البروتونات يتم فحصها، فإن الطريقة لا تحتاج إلى وضع علامات نظائرية ويمكنها الوصول إلى الميزات الهيكلية مثل الاقتران الأساسي المتحول مباشرة. المصصة هو وحدات تماما بمعنى أن R1rho الاسترخاء التشتت يمكن قياسها حتى لو تم إنتاج العينة مع طريقة مختلفة.
ابدأ بإعداد عينة البلازميد وإعداد نسخة في المختبر ورد فعل الانقسام كما هو موضح في مخطوطة النص. احتضان رد الفعل في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ثم تمييع ميكرولتر واحد من العينة عشرة أضعاف في تحميل الحل.
وتشغيل ميكرولتر واحد على هلام الصفحة denaturing. إذا كان رد فعل الانقسام ناجحا، قم بتحجيم التفاعل مع الحجم المطلوب وتشغيله بين عشية وضحاها. ثم تشغيل هلام الصفحة آخر denaturing وتقييم ما إذا كان قد تم الانتهاء من رد فعل الانقسام.
في حالة عدم اكتمال الانقسام، سخني محلول التفاعل في ميكروويف تقليدي عند 450 واط لمدة 15 ثانية. ثم يبرد الحل ببطء إلى 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة لإعادة توجيه الحمض النووي الريبي ودليل الانقسام. ولاحظ تشكيل عجلة جديدة.
إضافة المزيد من البيروفيوسفاتاز غير العضوية وRNase H.Incubate رد الفعل لمدة ساعة إلى ثلاث ساعات في 37 درجة مئوية. ثم تأكد من الانتهاء من رد فعل الانقسام مع إزالة النبج الصفحة. عند اكتمال رد فعل الانقسام RNase H، إخماد رد الفعل عن طريق إضافة EDTA إلى تركيز نهائي 50 ملليمولار.
ودوامة تماما. تصفية الحل من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرون. وتركيز الحل لحجم حقنها في نظام HPLC لتنقية.
قبل إضافة عينة مركزة ومنقى إلى أنبوب NMR، تنظيف الأنبوب عن طريق التنظيف مع وفرة المياه. ثم RNase إزالة التلوث الكاشف، والمياه، و 95٪ الإيثانول. بعد الشطف النهائي بالماء، اتركيه لتجف.
شطف المكبس بالماء واستخدام مسح خالية من الوبر لتنظيف مع كاشف إزالة التلوث RNase و 95٪ الإيثانول. بعد تجفيف الأنبوب والمغطاس، أضف 10٪ D2O إلى عينة NMR. استخدام تلميح ماصة كبيرة لنقل عينة الحمض النووي الريبي في أنبوب NMR، تتدفق على طول الجانب من جدار أنبوب.
أدخل المكبس في الأنبوب عن طريق دفعه لأسفل مع حركة التواء سريعة لإزالة فقاعات الهواء ، ثم سحب المكبس ببطء دون إنشاء فقاعات هواء جديدة. وإصلاحه مع فيلم شمع البارافين. إنشاء مجموعة بيانات جديدة على أساس مجموعة بيانات الكربون البروتون العطرية HSQC المستخدمة على عينات الحمض النووي الريبي المسمى بالكامل لتخصيص الحمض النووي الريبي.
تعيين المعلمات العامة والمعلمات الخاصة RD. ثم تعيين البروتون تدور قفل السلطة إلى 1.2 كيلوهرتز للاختبار. إنشاء قائمة vd اختبار مع إدخال واحد فقط، صفر ميلي ثانية، تعيين TDF1 إلى واحد، وتحديث D30 لتشغيل طيف اختبار.
بعد إعداد قائمة VD اختبار تحديث D30 و TDF1. ورسم كثافة الذروة لأطوال قفل تدور مختلفة. تحديد طول قفل الدوران الذي تنخفض فيه كثافة الذروة الأصلية إلى الثلث.
من نتيجة تشغيل الاختبار، قم بإنشاء قائمة vd النهائية لاستخدامها في التجربة. حدد عدد عمليات المسح الضوئي بحيث يكون لأضعف قمة في القائمة نسبة إشارة إلى ضوضاء لا تقل عن 10. تظهر هنا نتائج العديد من ردود الفعل الانقسامية للنصوص المترادف.
تم إنشاء 20 النيوكليوتيدات الهدف الجيش الملكي النيبالي في رد فعل ناجح. وأسفرت ردود الفعل غير الناجحة عن انشقاق غير كامل ومفشل للعينة. كشفت حقن HPLC من عينة الحمض النووي الريبي ذروة للجيش الملكي النيبالي الهدف النقي في 38 دقيقة.
في حين تم فصل المنتجات الأطول والأقصر بشكل جيد عن ذروة الاهتمام. أظهر تحليل دبوس شعر الحمض النووي الريبي أن عدد بروتونات إيمينو الملاحظة يطابق عدد بروتونات إيمينو المتوقعة من محاكاة البنية الثانوية. أظهر طيف الكربون البروتون HSQC من الرنين العطري للجيش الملكي النيبالي أربع إشارات بعد طيه.
وثلاث إشارات فقط قبل طيها. في ممثل على منحنيات الرنين التي تم الحصول عليها لاثنين من ذرات H8 مختلفة واثنين من دبابيس الشعر الحمض النووي الريبي الاصطناعية المختلفة، والخبرات G6H8 تبادل تأكيدي. في حين أن A4H8 لا.
بالنسبة إلى G6H8، تم اختيار قوى قفل الدوران الملونة وتسجيل بيانات الرنين. في بناء CG حيث التبادل بطيء، قيم الصف R1rho مقابل مؤامرة تعويض عرض بالفعل عدم تماثل طفيف من المنحنى، مما يدل على علامة على الفرق التحول الكيميائي دلتا أوميغا. هذا يصبح أكثر وضوحا في R2 بالإضافة إلى مؤامرة ريكس حيث تتم إزالة مساهمة R1.
من ناحية أخرى ، فإن بناء GC الخبرات أسرع تبادل وقيم R1rho مقابل مؤامرة تعويض قدم منحنى أوسع حيث استخراج أوميغا دلتا يصبح أقل وضوحا حتى في مؤامرة R2 زائد ريكس. وبمجرد توضيح ديناميكيات الحمض النووي الريبي، يمكن وصف الولايات ومحاصرتها. ويمكن، على سبيل المثال، اختبار هذه الدول المحاصرة في المقايسات البيولوجية.
هذه الطريقة تسمح لنا لمراقبة وظيفية، والتحولات الاقتران قاعدة ذات الصلة في مجمع ميرنا ميكرورنا النشطة، وإعادة ترتيب حلقة في الحمض النووي الريبي ريبوسومال، والاستقرار زوج قاعدة من على انتفاخات النيوكليوتيدات واحد.
نظرة عامة
يحدد هذا البروتوكول تحضير عينات الحمض النووي الريبي وإعداد القياسات المتناثرة للاسترخاء R1ρ للبروتون باستخدام تقنية الرنين المغناطيسي النووي. ويركز على تحضير العينات عالية النقاء للتحقيق في التبادل المطابق في جزيئات الحمض النووي الريبي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- الكيمياء الحيوية
- الرنين المغناطيسي النووي (NMR) الطيفي
الخلفية
- ديناميات الحمض النووي الريبي حاسمة لفهم الوظائف الجزيئية.
- توفر القياسات المتناثرة للاسترخاء R1ρ للبروتون رؤى حول التغيرات المطابقة.
- تعد عينات الحمض النووي الريبي عالية النقاء ضرورية لقياسات الرنين المغناطيسي النووي الدقيقة.
- تتيح هذه الطريقة الملاحظة المباشرة للسمات الهيكلية دون الحاجة إلى تسمية نظيرية.
هدف الدراسة
- تطوير بروتوكول موثوق لتحضير عينات الحمض النووي الريبي.
- استخدام تقنية الرنين المغناطيسي النووي لدراسة الديناميات المطابقة للحمض النووي الريبي.
- تعزيز فهم تفاعلات الحمض النووي الريبي واستقراره.
الطرق المستخدمة
- تحضير عينات البلازميد والنسج الخلوي في المختبر.
- تحليل جل PAGE المفصل لتأكيد تفاعلات الشق.
- تنقية عينات الحمض النووي الريبي بواسطة HPLC قبل تحليل الرنين المغناطيسي النووي.
- قياس الانتشار المتناثر للاسترخاء R1ρ لتقييم التبادل المطابق.
النتائج الرئيسية
- الجيل الناجح للحمض النووي الريبي المستهدف مع الشق المؤكد.
- تحديد التبادل المطابق في هياكل الحمض النووي الريبي المحددة.
- ملاحظة إشارات NMR مميزة تتوافق مع حالات طي الحمض النووي الريبي.
- توصيف ديناميات الحمض النووي الريبي والآثار البيولوجية المحتملة.
الاستنتاجات
- يمكن البروتوكول من تحليل مفصل لديناميات الحمض النووي الريبي.
- تسهم النتائج في فهم دور الحمض النووي الريبي في العمليات البيولوجية.
- قد تشمل التطبيقات المستقبلية اختبار تفاعلات الحمض النووي الريبي في المقايسات البيولوجية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Direct measurement of RNA conformational dynamics using 1H R1ρ relaxation dispersion NMR enables atomic-resolution insight into transient structural states critical for RNA function. This capability addresses a key discovery-stage challenge by revealing dynamic states inaccessible to most structural methods, supporting predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking. The protocol's modularity and compatibility with both labeled and unlabeled RNA samples enhance its portfolio relevance for early-stage biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of RNA conformational dynamics underlying functional mechanisms.
- Supports biological de-risking by directly observing base-pairing shifts and transient states.
- Facilitates predictive confidence in RNA-targeted therapeutic hypotheses.
Screening & Assay Development
- Prepares high-purity RNA samples suitable for quantitative NMR-based assays.
- Standardizes sample preparation and NMR setup for reproducible, scalable workflows.
- Delivers quantitative readouts of exchange rates and population distributions for downstream screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns atomic-level RNA dynamics with disease-relevant structural transitions when applicable.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by characterizing functionally relevant RNA states.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on mechanistic insight into RNA behavior.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing to preclinical model development, providing a reusable platform for RNA structural analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by revealing hidden RNA conformational states.
- Screening: Ensures assay readiness and reproducibility through standardized sample and NMR preparation.
- Analytics: Provides quantitative measurements of exchange rates, populations, and secondary structure changes.
- Translational Research: Connects atomic-resolution RNA dynamics to functional and disease-relevant outcomes when supported by data.
- Enterprise Reuse: Offers a modular workflow adaptable to various RNA constructs and production methods.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in RNA-targeted programs.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable sample preparation and NMR workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early detection of functional RNA states.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of RNA-targeted assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA biochemistry and NMR spectroscopy for optimal execution.
- Needs access to high-field NMR instrumentation and analytical infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of sample handling and data analysis.
- Adaptable to both isotopically labeled and unlabeled RNA, increasing flexibility across model systems.
- Sample purity and concentration are critical for reliable quantitative outputs.
