إنشاء ثقافات ثنائية مستقرة من Saccharibacteria التكافلية من تجويف الفم

Saccharibacteria هي الطفيليات الملزمة التي تتطلب ثقافة مشتركة مع البكتيريا المضيفة المناسبة. كما يمكن عزل البكتيريا الفموية البشرية بسهولة بالنسبة لمعظم الأفراد باستخدام الأنواع البكتيرية المضيفة المعروفة. سيسمح هذا البروتوكول لأي محقق أو مختبر بعزل سلالاته الخاصة في الثقافة الثنائية المشتركة.

تستخدم هذه التقنية أجهزة ومعدات بسيطة موجودة في معظم المختبرات الميكروبيولوجية وقد استخدمت بنجاح زراعة أكثر من 30 عزلة تمثل ستة أنواع من البكتيريا الميكارية. قد يكون هذا البروتوكول مفيدا لعزل أنواع الإشعاع الأخرى التي يتبعها المرشح ، وكذلك البكتيريا الساكارية من بيئات مختلفة وثدييات أخرى إذا كان من الممكن تحديد المضيفين البكتيريين المناسبين وعزلهم. إثبات الإجراء سيكون أندرو كولينز، زميل ما بعد الدكتوراه السابق في مختبري.

للبدء ، ابدأ زراعة البكتيريا المضيفة مثل arachnia propionica ، مع ما يكفي من الوقت لنموها إلى مرحلة ثابتة مبكرة. لبدء الثقافة، تلقيح 2-5 ملليلتر من مرق الصويا المحاولة التي تحتوي على 0.1٪ استخراج الخميرة مع بروبيونيكا العنكبوتية، واحتضانه في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد ذلك، تجميع أصحاب مرشح مع المسار محفورا 0.2 ميكرومتر أغشية التصفية.

التفاف عليها في احباط وتعقيمها عن طريق الالاستعباد التلقائي، جنبا إلى جنب مع أنابيب الطرد المركزي والجمعيات سقف. تعقيم الإمدادات الإضافية في حالة الاتصال العرضي مع الأسطح غير العقيمة. جمع لوحة الأسنان عن طريق كشط على طول خط اللثة، وذلك باستخدام نقطة ورقة معقمة، كوريت رشيق، أو مسواك معقمة أو تلميح ماصة، ونقله إلى عازلة مناسبة مثل MRD أو PBS.

إبقاء العينة على الجليد حتى تصبح جاهزة للمضي قدما. إعادة تأمين لوحة الأسنان بقوة باستخدام مزيج من الدوامة والأنابيب مع طرف ماصة صغيرة، ثم إضافة عينة لوحة resuspended إلى أنبوب يحتوي على تسعة ملليلتر من العازلة MRD. فك بعناية تجميع فلتر معقم باستخدام تقنية مطهرة.

Untwist بدوره ربع ، وإعادة تشديد حامل مرشح لضمان أن تشارك بشكل صحيح المواضيع ، ويتم إغلاق الجهاز بشكل صحيح. غسل الغشاء عن طريق تمرير 10 ملليلتر من العازلة MRD من خلال الجهاز، وذلك باستخدام حقنة. لتطبيق العينة على الفلتر المغسول، قم بإزالة المكبس من حقنة وإرفاقه بجهاز التصفية.

ضع أنبوب طرد مركزي معقم تحت جهاز التصفية هذا للقبض على الفيلترات ، ثم صب عينة الأسنان المتناثرة في الحقنة وتحميلها على الفلتر. ثم تطبيق ضغط الضوء على المكبس لدفع العينة من خلال مرشح. غسل الغشاء مع 10 ملليلتر أخرى من العازلة MRD، وجمع تدفق من خلال في نفس أنبوب العينة المصفاة.

ثم قم بسقف الأنبوب بشكل مطهر، والحفاظ على الجليد. وضع علامة توجيه على الأنبوب والغطاء لتحديد موقع بيليه الخلية بعد الطرد المركزي. ضع الأنبوب في جهاز طرد مركزي عالي السرعة مع العلامة على الجانب العلوي واطرد العينات عند 60,000 G لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية.

بعد الطرد المركزي، صب بعناية من supernatant، والحفاظ على بيليه على الجانب العلوي من الأنبوب. ثم إعادة إنفاق بيليه في 1-2 ملليلتر من العازلة MRD عن طريق دوامة بقوة. إعداد أنابيب الثقافة عن طريق aliquoting اثنين من ملليلتر من وسائل الإعلام المناسبة النمو في الأنابيب.

ثم، إضافة 200 ميكرولتر من ثقافة بين عشية وضحاها من الكائنات الحية المضيفة و 100 إلى 200 ميكرولتر من عينة تصفية إعادة الإنفاق إلى كل أنبوب. احتضان العينات المجمعة في ظل ظروف مناسبة للكائن المضيف. مرور الخلايا كل يومين إلى ثلاثة أيام عن طريق نقل 200 ميكرولتر من الثقافة الثنائية إلى اثنين من ملليلتر من متوسط النمو الطازج في أنبوب جديد.

إذا لم تظهر الثقافات الممرة أي نمو في 200 ميكرولتر من الثقافة المضيفة غير المصابة ، عند تمرير الخلايا ، فإرجاع الأنابيب الملقحة إلى الحاضنة. Aliquote 24 ميكرولتر من مزيج PCR الرئيسي في أنبوب PCR 0.2 ملليلتر. في ميكرولتر واحد من الثقافة المصابة saccharibacteria، ضع الأنبوب في دورة الحرارية.

تعيين برنامج PCR كما هو موضح في المخطوطة النصية. تحميل وتشغيل منتجات PCR على هلام Agros 1٪. وهناك مجموعة من حوالي 600 قاعدة تؤكد وجود saccharibacteria.

لتأكيد نقاء الثقافات الإيجابية ، قم بإجراء تخفيف تسلسلي 10 أضعاف للثقافة المشتركة للساكاريكتريا في عازل معقم ، ونشر 100 ميكرولتر على طبق أجار. احتضان الثقافة في ظل ظروف النمو المناسبة ومراقبة الكائنات الحية الملوثة. وهناك مجموعة من حوالي 600 قاعدة تؤكد وجود saccharibacteria.

قد يظهر الكشف عن PCR سلبيا في ثقافات العدوى الأولية بسبب انخفاض عدد symbionts saccharibacteria. ومع ذلك ، بعد بضعة مقاطع ، يجب أن يظهر منتج PCR قوي ، مما يشير إلى حدوث عدوى مستقرة. اختبار العديد من الأنواع المضيفة مع نفس filtrate saccharibacteria وعادة ما يكون معدل نجاح منخفض.

كما التفاعل المضيف symbiont محددة جدا. ومع نمو الثقافات المصابة، ينبغي أن يظهر النمو العكر الطبيعي. ومع ترسيخ التكافل نفسه، تبدو الثقافات المصابة أقل عكرة من ثقافات الكائنات المضيفة غير المصابة.

يمكن تنقية ثقافة ملوثة عن طريق التقاط المستعمرات المصابة بعد الطلاء. يمكن في بعض الأحيان تحديد المستعمرات المصابة عن طريق شكل مستعمرة غير منتظم مقارنة بالمستعمرات غير المصابة. تعتمد نسبة المستعمرات العادية على تأليه الساكاريكتريا في الثقافة الثنائية.

إذا كان titer منخفضة، سوف تظهر عدد أقل من المستعمرات غير النظامية، مما يجعل من السهل لاختيار المستعمرات المصابة وبدء ثقافة ثنائية نقية. قد لا تبدو الثقافات إيجابية لعدة مقاطع. لذلك ستكون هناك حاجة إلى بعض المرضى.

ومن الضروري أيضا للتحقق بانتظام من تلوث الثقافات الثنائية، لأن هذا يمكن أن تزعزع استقرار الثقافة ويؤدي إلى وفاة saccharibacteria. يمكن استخدام الثقافة الثنائية لجميع أنواع التجارب المختبرية. ويمكن استخراج الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي لتسلسل الجينوم وتحليل النسخ، على التوالي.

كما يمكن التحقيق في الإمراض باستخدام نماذج حيوانية.