الكشف عن الأجسام المضادة المحايدة للسارس-CoV-2 باستخدام التصوير الفلوري عالي الإنتاجية للعدوى بالفيروس الزائف

يحدد البروتوكول الموصوف هنا طريقة سريعة وفعالة لقياس تحييد الأجسام المضادة ضد بروتين ارتفاع السارس-CoV-2 من خلال تقييم قدرة عينات المصل النقاهة على منع العدوى عن طريق فيروس التهاب الفم الفلوري الأخضر المعزز المسمى بالبروتين المركبات الزائف مع ارتفاع الجليكوبروتين.

وتوفر هذه الطريقة طريقة للإجابة على أحد الأسئلة الأكثر أهمية المتعلقة بلقاحات الفيروس التاجي-2 التي هي قيد التطوير. هل اللقاح قادر على الحصول على استجابة الأجسام المضادة المحايدة؟ والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن القيام به في مرفق من المستوى الثاني للاحتواء.

كما أنها سريعة نسبيا وغير مكلفة، مما يجعلها مناسبة تماما لتحليل العديد من العينات في وقت واحد. مما يدل على إجراء حمض تحييد، لدينا ريكاردو ماريوس، وهو فني كبير في المختبر وتايلور جيميسون، وهو طالب دكتوراه دكتوراه. تبدأ بزراعة خلايا Vero E6 في DMEM تكملها 10٪ FBS في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

لتمرير الخلايا، أولا غسلها عن طريق إضافة 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني وهزاز بلطف الطبق أربع إلى خمس مرات. بعد أسبيراتينغ برنامج تلفزيوني، إضافة ثلاثة ملليلتر من EDTA تريبسين والصخور الطبق لضمان أن يتم تغطية السطح بأكمله قبل احتضانه في 37 درجة مئوية. بمجرد انفصال الخلايا، قم بتعطيل التريبسين بإضافة سبعة ملليلترات من DMEM تكملها 10٪ FBS، ثم إعادة إنفاق الخلايا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا عدة مرات.

إزالة التريبسين عن طريق الطرد المركزي و يستنشق supernatant دون إزعاج بيليه الخلية قبل إعادة تعليق الخلايا في 10 ملليلتر من DMEM الطازجة. بعد العد، إضافة ما يقرب من مرة واحدة 10 إلى الخلايا السابعة إلى كل لوحة 15 سم واحتضان الثقافة لمدة يوم إلى يومين حتى الخلايا هي التقاء 100٪. لإعداد VSV ارتفاع EGFP الزائفة للتيتر، تصيب الخلايا في 0.01 تعدد العدوى مع فيروس الأسهم المخفف في 12 ملليلتر من DMEM خالية من المصل.

بعد إضافة الفيروس، احتضان الخلايا لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون مع هزاز عرضية. في نهاية الحضانة، استبدل الإنكولوم ب DMEM الطازجة المكملة ب 2٪ FBS و 20 كومة ملليمولار، ثم احتضن الخلايا عند 34 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي، استخدم مجهر الفلورسنت لتصور تعبير EGFP للخلايا المصابة.

بمجرد ملاحظة تأثير اعتلال الخلايا واسعة النطاق وانفصال الخلية، وجمع الثقافة الفائقة وإزالة الحطام عن طريق الطرد المركزي. لتجنب دورات التجميد والذوبان المتعددة ، أكوت supernatant قبل التخزين في ناقص 80 درجة مئوية. لتحديد التيتر الفيروسي، لوحة خلايا Vero E6 في ست لوحات بئر في كثافة البذر من ست مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل بئر واحتضان بين عشية وضحاها.

في اليوم التالي ، قم بإعداد سلسلة تخفيف تسلسلية عشرة أضعاف من المخزون الفيروسي عن طريق إضافة 900 ميكرولتر من أنابيب الطرد المركزي المتوسطة إلى السبعة الصغيرة وإضافة 100 ميكرولتر من المخزون الفيروسي إلى الأنبوب الأول. بعد دوامة قصيرة، نقل 100 ميكرولتر من الفيروس المخفف إلى كل أنبوب لاحق، دوامة بين كل أنبوب. ثم استبدال supernatant في كل بئر من لوحة الثقافة E6 فيرو مع 500 ميكرولتر من 10 إلى ناقص الثانية إلى 10 إلى تخفيف الفيروسية السابعة ناقص.

بعد حضانة لمدة 45 دقيقة في حاضنة ثقافة الخلية مع هزاز بلطف كل 15 دقيقة، واستبدال inoculum مع محلول تراكب واحتضان الخلايا في 34 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة. في نهاية الحضانة ، لتصور لويحات عن طريق تلطيخ الكريستال البنفسجي ، وغسل الخلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني قبل إضافة اثنين من ملليلتر من 0.1 ٪ البنفسجي الكريستال إلى كل بئر. ضع الطبق على الروك لمدة 20 دقيقة تقريبا في درجة حرارة الغرفة قبل غسل كل بئر بلطف مرتين مع PBS.

بعد الغسيل الأخير، اسمح للصفائح بالجفاف لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل استخدام التركيبة كما هو مبين لحساب تتر الفيروس في كل بئر في وحدات تشكيل البلاك لكل ملليلتر. للوحة الخلايا لإجراء فحص تحييد، استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 100 ميكرولتر من خلايا Vero E6 إلى كل بئر من لوحة بئر 96 بكثافة ضعفين 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر، واحتضان اللوحة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي، الحرارة تعطيل عينات مصل المريض ليتم اختبارها في حمام مائي 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

ثم إعداد سلسلة تخفيف عشرة أضعاف من عينات مصل المريض في لوحة فارغة 96 زراعة أنسجة البئر عن طريق إضافة ثمانية ميكرولتر من المصل إلى 72 ميكرولتر من DMEM خالية من المصل مع المضادات الحيوية في كل حسنا من الصف A.Then إضافة 40 ميكرولتر من DMEM خالية من المصل إلى كل بئر من الصفوف B إلى G و 80 ميكرولتر إلى كل بئر من الصف H.Using ماصة متعددة القنوات 12 جيدا، خلط العينات في الصف A، ثم نقل 40 ميكرولتر من العينة من كل بئر من الصف A إلى كل بئر من الصف B.After خلط، كرر التخفيف لكل صف لاحق من الآبار حتى الصف F.Next، إضافة 40 ميكرولتر من VSV ارتفاع EGFP في 0.05 تعدد العدوى إلى كل بئر في الصفوف من ألف إلى زاي، وتخلط عن طريق الأنابيب أربع إلى خمس مرات قبل احتضان لوحة لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في نهاية الحضانة ، يستنشق بعناية الفائق من كل بئر من لوحة ثقافة Vero E6 ونقل 60 ميكرولتر من خليط فيروس الأجسام المضادة من كل بئر من لوحة تخفيف العينة إلى البئر المقابلة للوحة ثقافة الخلية. عندما يتم نقل جميع العينات، ضع لوحة زراعة الخلية عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة مع هزاز كل 20 دقيقة.

بعد اكتمال الحضانة، أضف 140 ميكرولتر من محلول تراكب كاربوكسي ميثيل سيلولوس إلى كل بئر من لوحة ثقافة الخلية ونقل اللوحة إلى حاضنة 34 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد 24 ساعة، قم بتصوير اللوحات على صور فلورية آلية بطول موجي 488 نانومتر، واستخدم ميزة العد الآلي للصور لتحديد بؤرة EGFP الفردية. في هذا المثال التمثيلي، تم استخدام الأجسام المضادة المحايدة المتاحة تجاريا ضد مجال ربط مستقبلات الفيروس التاجي-سارس-2 كتحكم إيجابي، إلى جانب IgG كتحكم سلبي.

تم حساب تثبيط النسبة المئوية استنادا إلى عدد بؤر EGFP التي تم اكتشافها عن طريق التصوير الفلوري. وقد أظهر تحييد الفيروس الزائف عن طريق عينات المرضى النقاهة التي تم جمعها بعد ثلاثة أشهر تقريبا من عدوى فيروس كورونا-2 أن المرضى في المستشفيات أظهروا زيادة في القدرة على تحييد المرضى مقارنة بأولئك الذين لم يحتاجوا إلى دخول المستشفى. يمكن استخدام هذا الإجراء أيضا لتقييم عوامل الوقاية والعلاج الأخرى COVID-19 التي تهدف إلى منع العدوى الفيروسية.