الكشف عن الأجسام المضادة للمجال الملزمة للمستقبلات من سارس-CoV-2 باستخدام جهاز تقرير حيوي قائم على HiBiT

مختبري يعمل في أبحاث COVID-19، وقد طورنا مؤخرا فحصا جديدا سمح لنا بالكشف بسرعة ودقة عن الأجسام المضادة للسارس-CoV-2. يحدد هذا البروتوكول فحصا عاليا للنسب للكشف عن الأجسام المضادة للسارس-COV-2 في عينات مصل المريض، وهو أمر بالغ الأهمية نظرا للوباء الحالي. غالبية المقايسات المصلية الحالية تضحي بالسرعة من أجل الحساسية أو العكس بالعكس.

تظهر بياناتنا أن المقايسة لدينا حساسة ولديها وقت استجابة سريع. من أجل إنتاج كمية كافية من HiBiT-RBD عالية التقارير الحيوية، تبدأ بالتحضير لثقافة الخلية. أولا، إعداد كامل دولبيكو تعديل النسر المتوسطة التي تحتوي على 10٪ مصل البقر الجنين و 1٪ البنسلين والستريبتوميسين.

ثم تدفئة وسائل الإعلام في حمام مائي 37 درجة مئوية. تشغيل خزانة السلامة البيولوجية واستخدام الإيثانول 70٪ لتعقيم سطح الخزانة. زراعة خط الخلية، أخرجه من ناقص 80 درجة مئوية أو النيتروجين السائل وتذوب في حمام مائي 37 درجة مئوية.

امزج الخلايا المذابة مع ما لا يقل عن 10 ملليلتر من الوسط الكامل. ماصة تعليق الخلية في طبق بيتري 15 سنتيمترا ودوامة لوحة لتوزيع الخلايا بشكل موحد. ضع الطبق في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية ، و 5 ٪ من ثاني أكسيد الكربون ، والرطوبة 85 إلى 95٪.

مراقبة الخلايا تحت المجهر حتى يصل مستوى التقاء 80 إلى 90٪ عند التقاء عالية، وإزالة المتوسطة، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني دافئ وإضافة ثلاثة إلى خمسة ملليلتر من 0.25٪ تريبسين-EDTA لفصل الخلايا من السطح. بعد ما يقرب من خمس دقائق، ننظر في الخلايا تحت المجهر. إذا كانت جميع الخلايا عائمة، أضف أربعة ملليلترات على الأقل من المتوسط ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب معقم جديد.

عد الخلايا باستخدام مقياس الدم وإضافة مليون خلية في كل بئر من لوحة من ستة آبار لtransfection. لإجراء عملية نقل ل HiBiT-RBD plasmid، استخدم ميكروجرام واحد من تعبير HiBiT-RBD البلازميد مع كاشف نقل مناسب. احتضان لمدة 10 إلى 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم إضافة الحجم الإجمالي إلى كل بئر من لوحة دروبوايز.

في اليوم التالي، استبدل الوسط الذي يحتوي على خليط العدوى بمتوسط كامل. مراقبة التحكم في العدوى جيدا بعد 48 ساعة من العدوى. جمع supernatant في 1.5 ملليلتر الأنابيب الدقيقة.

إضافة 500 ميكرولتر من 1X العازلة تحلل سلبي أو PLB إلى الخلايا، ثم احتضان ويهز لوحة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتحلل الخلية. بعد ذلك ، لتقييم إشارة التلألؤ من المبلغ الحيوي باستخدام مقايسة لوسيفيراز ، قم أولا بإعداد مكونات التفاعل واستخدام الفائق كمصدر للمراجز الحيوي. تمييع BiT كبيرة والركيزة إلى 1X قبل الاستخدام.

نقل 50 ميكرولتر من supernatant من كل بئر أو أنبوب إلى لوحة 96 جيدا وإضافة 50 ميكرولتر من 1X BiT كبيرة لكل بئر. احتضان لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. فتح برنامج لومينوميتر، إضافة 50 ميكرولتر من ركيزة 1X إلى كل بئر، ووضع لوحة في لومينوميتر وتشغيل البرنامج.

من أجل إجراء اختبار الكشف عن الأجسام المضادة HiBiT-RBD ، قم بإعداد التقرير الحيوي HiBiT-RBD كما هو موضح سابقا والجمع بين 50 ميكرولتر من HiBiT-RBD التي تحتوي على ميكرونات واحد مع ميكروجرام واحد من الأجسام المضادة التجارية سارس-CoV-2 RBD في ميكروب 1.5 ملليلتر. إضافة 20 ميكرولتر من البروتين المناعي ملزمة أو البروتين G إلى الحل. رفع الحجم الإجمالي إلى 300 ميكرولتر بإضافة برنامج تلفزيوني.

احتضان الأنابيب على أنبوب شاكر أو الدوار لمدة 30 دقيقة. جهاز طرد مركزي في 12، 000 G لمدة 30 ثانية. ثم تجاهل supernatant وغسل مع برنامج تلفزيوني.

كرر العملية ثلاث مرات لإزالة HiBiT-RBD مجانا. Resuspend الخلايا في 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني ونقله إلى لوحة 96 جيدا. إضافة 50 ميكرولتر من 1X BiT كبيرة وانتظر لمدة خمس دقائق.

ثم أضف 50 ميكرولتر من ركيزة NanoLuc 1X. قراءة فورا إشارة التلألؤ مع لومينوميتر. إعداد كميات أكبر من HiBiT-RBD بيوبورتر لإجراء فحص الإنتاجية العالية والجمع بين 20 ميكرولتر من البروتين المغناطيسي G مع 50 ميكرولتر من HiBiT-RBD supernatant في كل بئر من لوحة 96 جيدا لكل عينة.

إضافة 10 ميكرولتر من عينة المصل إلى كل بئر وبذلك يصل الحجم الإجمالي إلى 150 ميكرولتر عن طريق إضافة برنامج تلفزيوني. احتضان لمدة 30 دقيقة على شاكر في درجة حرارة الغرفة. ثم ضع اللوحة على غسالة مغناطيسية لتسريع مجمع الأجسام المضادة البروتين G.

تجاهل الحل في القسم الأوسط من كل بئر وإضافة برنامج تلفزيوني للغسيل. كرر خطوة الغسيل ثلاث مرات على الأقل لإزالة HiBiT-RBD الزائدة. إضافة 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X و 50 ميكرولتر من 1X BiT كبيرة واحتضان لمدة خمس دقائق على الأقل في درجة حرارة الغرفة.

إعداد برنامج قياس اللمومتر. ثم أضف 50 ميكرولتر من ركيزة 1X. ضع اللوحة في الجهاز، تشغيل البرامج وتسجيل الإشارات.

قارن الإشارات من عينات المصل وعينات التحكم وإشارة الخلفية من الآبار الفارغة. تم تسجيل الإشارات من كل من HiBiT-RBD التي تحتوي على lysate الخلية وsupernatant من الخلايا المصابة لتقييم مصدر البروتين المناسب. وأظهرت البيانات خلفية منخفضة مقارنة بإشارة قوية عندما تم الجمع بين كلا الجزءين.

إضافة البروتين G يساعد الأجسام المضادة هطول الأمطار. وقد استخدم هذا الفحص لمقارنة الاشارة من جهاز مضاد تجاري لتحييد السارس-كوف-2 مع جهاز IgG مسيطر. كانت إشارة الجسم المضاد المحددة قوية ، في حين كان الجسم المضاد للتحكم قريبا من مستوى الخلفية الإنارة.

تم استخدام فيروس التهاب الفم الوهن الموهن أو VSV مع طفرة في الموضع 51 من بروتين M الذي يعبر عن RBD الخارجي لتطعيم الفئران. أنتج المصل الذي تم جمعه من الفئران الملقحة إشارة قوية مقارنة مع عدم وجود إشارة في الفئران التي تم حقنها باستخدام VSV التحكم. ويمكن استخدام هذا البروتوكول للكشف عن الأجسام المضادة للسارس-CoV-2 في عينات مصل المريض.

تعتبر خطوات الغسيل التالية للحضانة باستخدام Protein G أمرا حاسما لتقليل الخلفية. بالإضافة إلى ذلك، من المهم إضافة الركيزة في أسرع وقت ممكن لتجنب فقدان الإشارة. ومع بعض الخطوات الإضافية للتحسين، يمكن استخدام نفس المقايسة لتحليل عينات الدم ويمكن أن تكون طريقة فعالة لتحديد الأجسام المضادة المضادة للسارس-COV-2 في عينات دم المرضى.