تحليل تقييد SAMHD1 عن طريق قياس التدفق الخلوي في خلايا U937 النخاعية البشرية

مع تزايد الاهتمام بدور العوامل الخلوية في عدوى فيروس نقص المناعة البشرية من البلاعم ، قمنا بتطوير نظام تحليل مرن ، خاصة بالنسبة ل SAM HG one ، والذي لا يتم التعبير عنه في خلايا U937. الميزة الرئيسية للنظام هي مرونته. بمجرد إعداده ، يمكن استخدامه لتحليل مجموعة متنوعة من البروتينات أو الخلايا أو الفيروسات المستهدفة.

من المهم الحفاظ على صحة الخلايا وأيضا أن تكون مرتاحا لقياس التدفق الخلوي متعدد الألوان. قم بتشغيل مقياس الخلايا والكمبيوتر قبل 10 دقائق من بدء التحليل. تأكد من أن النفايات فارغة وأن خزان الغمد ممتلئ.

ثم قم بتسجيل الدخول وافتح برنامج التحليل. بعد تحريك الذراع ، ارفع أنبوب الماء. اضبط معدل التدفق على عالي، ثم اضغط على زر Prime (prime).

انتظر حتى ينطفئ الضوء وكرر هذه العملية ثلاث مرات أخرى. ضع أنبوب الماء مرة أخرى واركض بمعدل تدفق مرتفع لمدة ثلاث دقائق. ثم اضبط معدل التدفق على مستوى منخفض واضغط على وضع الاستعداد حتى الاكتساب.

حدد تجربة، تجربة جديدة، واضغط على موافق لتحديد تجربة فارغة، وانقر بزر الماوس الأيمن على التجربة وأضف عينة جديدة. اضغط على موافق إلى لوحة فارغة. انقر بزر الماوس الأيمن لإعادة التسمية باسم مناسب وفتح العينة بالنقر فوق علامة الجمع للكشف عن أنبوب جديد.

انقر نقرا مزدوجا فوق الأنبوب لرؤية إعدادات مقياس الخلايا في المفتش. في قائمة المعلمات ، احذف الفلوروكرومات غير المطلوبة باستثناء الليزر الأزرق 53030 والليزر الأصفر 61020. في ورقة العمل، قم بإنشاء مخطط نقطة منطقة تشتت أمامية مقابل مخطط نقطة منطقة تشتت جانبي، ورسم بياني YFP، ورسم بياني لطلب تقديم العروض، ورسم نقطة RFP مقابل YFP بالنقر فوق الرمز المقابل وتغيير المحاور بالنقر فوق تسمية المحور.

قم بتحميل عنصر التحكم غير المصاب وغير المحول واضغط على زر التشغيل على الجهاز. ثم اضغط على اكتساب في لوحة معلومات الاستحواذ. اضبط فولتية التشتت الأمامية والجانبية في لوحة القيادة لوضع الخلايا في الربع السفلي الأيسر.

بوابة حول هذا السكان وتسميتهم باسم P واحد. انقر بزر الماوس الأيمن على المؤامرات الأخرى وحدد إظهار P one لإزالة الحطام من التحليل اللاحق. اضبط فولتية RFP و YFP لأسفل بحيث تقع الذروة على يسار الرسم البياني.

قم بتحميل عنصر تحكم اللون الواحد ل YFP واضغط على الاكتساب. اضبط جهد YFP في لوحة القيادة بحيث تكون معظم خلايا الفلورسنت ضمن نطاق الكاشف. ثم كرر نفس الشيء لعنصر تحكم RFP.

حدد التجربة. انتقل إلى إعداد التعويض وحدد إنشاء عناصر تحكم تعويض ولا بأس بالتبديل إلى ورقة عمل عادية ثم حدد ورقة عمل عادية غير ملطخة. اضغط أثناء الركض واحصل على التحكم غير الملطخ.

ارسم بوابة P واحدة حول الخلايا السليمة وسجلها. قم بإزالة الأنبوب ووضع الجهاز في وضع الاستعداد. انقر بزر الماوس الأيمن على P واحد.

انقر فوق تطبيق على جميع عناصر التحكم في التعويض وقم بالتبديل إلى ورقة العمل العادية ل RFP. اضغط على الجري ، وسجل عنصر تحكم RFP أحادي اللون وسيقوم البرنامج تلقائيا ببوابة الخلايا الإيجابية. ضع الجهاز في وضع الاستعداد وكرر نفس الشيء لعنصر تحكم YFP.

حدد التجربة، وانتقل إلى إعداد التعويض، وحدد حساب التعويض، ثم انقر على الرابط واحفظ. قم بالتبديل إلى ورقة العمل العمومية وارجع إلى أنبوب العينة. احصل على الخلايا المحولة بالنوع البري SAM HD One المصاب بفيروس نقص المناعة البشرية RFP ، وتحقق من أنه يمكن رؤية أربع مجموعات متميزة في زوايا الأرباع المحاذاة رأسيا وأفقيا ل YFP و RFP.

قم بإزالة الأنبوب واضغط على وضع الاستعداد. أعد تحميل العينة غير المحولة وغير المصابة واضغط على تشغيل. في لوحة معلومات الاستحواذ، اضبط بوابة التوقف على P one والأحداث لتسجيل 30000 حدث.

اضغط على السجل. كرر نفس الشيء بالنسبة للعينات وعناصر التحكم الأخرى عن طريق الضغط على الأنبوب التالي بين كل أنبوب. أعد تسمية العينات أثناء التشغيل أو ما بعد الصقر، وقم بتصدير البيانات كملفات FCS نقطية.

افتح البرنامج واسحب جميع ملفات FCS إلى لوحة المعلومات. حدد عناصر التحكم في التعويض واسحبها إلى المجلد الفرعي للتعويض. انقر نقرا مزدوجا فوق الأنبوب غير المحول وغير المصاب لفتح الملف وإعادة توجيه تشتت قطعة أرض مقابل تشتت جانبي.

حدد أداة المضلع والبوابة على مجموعة الخلايا السليمة باستثناء الحطام في الزاوية السفلية اليسرى وقم بتسميتها خلايا. انقل التسمية حتى لا تحجب الخلايا. اسحب هذه البوابة إلى جميع مجموعات الأنابيب في شريط جميع العينات.

قم بالتمرير عبر جميع السكان باستخدام أزرار الأسهم الأفقية لضمان بوابة مناسبة لكل أنبوب. انقر نقرا مزدوجا فوق الخلايا واضبط المحاور على الارتفاع مقابل المساحة. حدد المجموعة الكبيرة المفردة باستخدام بوابة مستطيلة لاستبعاد الثنائيات وللسماح للبرنامج باقتراح تسميتها كخلايا مفردة تلقائيا.

ثم اسحب هذه البوابة إلى جميع مجموعات الخلايا وتحقق من أن البوابة مناسبة لجميع العينات. حدد مجموعة الخلايا المفردة للعينة غير المصابة وغير المحولة. قم بتغيير المحور Y إلى ليزر أزرق تعويضي ل YFP ومحور X لتعويض الليزر الأصفر عن RFP.

حدد أداة البوابة الرباعية وانقر في أقصى اليمين العلوي من مجموعة الخلايا السلبية. قم بتطبيق هذا البوابة الأولية على جميع مجموعات الخلايا المفردة عن طريق السحب إلى البوابة الأصل في شريط جميع العينات. إذا كانت البوابات الرباعية لا تفصل السكان بشكل مرض ، فقم ببوابة الأرباع الفردية باستخدام أداة المضلع.

قم بالتمرير إلى النوع البري SAM HD عينة واحدة فقط للتحقق من البوابة الصحيحة بين الخلايا السلبية YFP غير المحولة والخلايا الإيجابية YFP. استخدم طريقة عرض الكفاف لتمييز الخلايا السالبة عن خلايا YFP الخافتة. استخدم أفضل تقسيم بين YFP السلبي والإيجابي الصالح لجميع العينات وقم بالتمرير عبر العينات للتحقق من البوابة فيما يتعلق بإيجابية YFP.

قم بالتمرير إلى عينة طلب تقديم العروض غير المحولة بفيروس نقص المناعة البشرية المصابة وتحقق مما إذا كانت البوابة بين طلب تقديم العروض السلبي غير المصاب وإيجابية طلب تقديم العروض المصاب صحيحة. استخدم طريقة عرض الكفاف إذا لزم الأمر وقم بالتمرير عبر العينات المتبقية للتحقق من أن البوابة صالحة لجميع العينات. تتطلب كل عينة أربعة أرباع.

Q1 YFP إيجابي ، Q2 إيجابي مزدوج ، Q3 RFP إيجابي و Q4 سلبي مزدوج. افتح محرر الجدول واسحب البوابات الرباعية الأربعة إلى لوحة المعلومات. حدد الملف والتفوق من القائمة المنسدلة.

اختر وجهة الملف وانقر على إنشاء جدول. احفظ جدول البيانات الذي تم إنشاؤه وفقا لاصطلاحات تسمية الملفات المحلية. انقر على أيقونة محرر التخطيط لتصدير تمثيلات المؤامرات واستراتيجيات البوابة.

حدد كل مجموعة سكانية واسحبها إلى المحرر باستخدام المحاور المطلوبة ووضع العلامات والتباعد. لإنشاء تخطيط بنفس المخططات المعروضة لجميع العينات ضمن قسم الدفعة، أدخل واحدا في العمود واضغط على إنشاء تقرير دفعي. في قائمة الملفات، حدد المقياس المراد عرضه وتجنب فواصل الصفحات.

ثم احفظ بتنسيق الملف المطلوب. في جدول البيانات المصدر، قم بإنشاء الأعمدة كما هو موضح في مخطوطة النص. استخدم برنامج تحليل البيانات المناسب لمتوسط نسخ البيانات لكل بنية SAM HD واحدة، وحساب قيم نسبة التقييد.

تم إنشاء مخططات YFP مقابل RFP تمثيلية للحصول على بيانات مثالية ودون المستوى الأمثل. وتشير خطة البيانات دون المستوى الأمثل إلى أن الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية كانت منخفضة للغاية وخلقت صعوبات في التعويض والبوابة. كانت نسبة التقييد 0.5 ، وهي أعلى من النسبة المتوقعة البالغة 0.3.

تم إنشاء مخططات نسبة التقييد لمتغيرات SAM HD one فيما يتعلق بالنوع البري والتحكم السلبي للحصول على البيانات المثلى ودون المستوى الأمثل. في البيانات المثلى ، أظهر النوع البري أن التقييد المتوقع يبلغ حوالي 0.2 والتحكم السلبي HD 206 إلى سبعة AA كان لديه نسبة تقييد 1.0. كان البديل R372D مختلفا اختلافا كبيرا عن النوع البري ، ولكنه لم يختلف اختلافا كبيرا عن التحكم السلبي وفقد القدرة على التقييد.

في البيانات دون المستوى الأمثل ، تصرفت السيطرة السلبية كما هو متوقع ولكن النوع البري أظهر نسبة تقييد بلغت 0.5 بسبب انخفاض معدل الإصابة. أظهر R143D نمطا ظاهريا وسيطا مختلفا إحصائيا عن النوع البري والتحكم السلبي. كان البديل G209S مختلفا اختلافا كبيرا عن النوع البري ولكنه لم يختلف اختلافا كبيرا عن التحكم السلبي وبالتالي فقد القدرة على التقييد.

من المهم أن يكون لديك الكثير من خلايا التحكم الخاصة بك خاصة إذا كنت جديدا في قياس التدفق الخلوي. بعد ذلك أو بالتوازي ، يمكن إجراء تحليل كيميائي حيوي لنفس الطفرات لتشكيل صورة شاملة.