فحص نشاط مقترن بإنزيم عالي الإنتاجية لفحص تفاعل الجزيء الصغير مع dNTPase SAMHD1

تسمح لنا هذه الطريقة بتوصيف أدوية العلاج الكيميائي التي يتم تحللها بواسطة SAMHD1 ويمكن استخدامها كفحص فحص لتحديد مثبطات الجزيئات الصغيرة لهذا الإنزيم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها بسيطة وغير مكلفة وتنتج كمية هائلة من المعلومات حول كيفية تفاعل الجزيئات الصغيرة المختلفة مع هذا الإنزيم. ومن بين المبادرين إلى إجرائه، ستكون ميريام، وهي باحثة ما بعد الدكتوراه من المجموعة.

للبدء ، قم بإعداد المخزن المؤقت الكامل لتفاعل SAMHD1 عن طريق إضافة Tween-20 و TCEP إلى التركيزات النهائية البالغة 0.005٪ و 0.3 مليمولار على التوالي. قم بإعداد محلول إيقاف EDTA عن طريق إضافة EDTA إلى تركيز نهائي يبلغ 7.9 مللي مولار في محلول تفاعل SAMHD1 كامل. قم بإعداد محلول عمل الملكيت الأخضر ، أو MG عن طريق خلط 10 أجزاء من محلول مخزون MG مع 2.5 جزء من 7٪ موليبدات الأمونيوم و 0.2 جزء من 11٪ Tween-20.

باستخدام ماصة متعددة القنوات ، قم بتخفيف مركبات الاختبار بشكل متسلسل في المذيب ذي الصلة عند 100 ضعف التركيز النهائي في لوحة شفافة مستديرة القاع من مادة البولي بروبيلين 96 بئرا. قم بتخفيف هذه المركبات إلى 25 ضعف التركيز النهائي باستخدام مخزن تفاعل SAMHD1 الكامل للحفاظ على تركيز المذيب النهائي أقل من 1٪ انقل خمسة ميكرولترات من المكون المخفف إلى الآبار المناسبة للوحة فحص مسطحة القاع 384 بئرا وكرر الإجراء مع عينات التحكم في المذيبات فقط. لإعداد مزيج الإنزيم الرئيسي ، قم بتخفيف بروتين SAMHD1 البشري المؤتلف وبيروفوسفاتيز المؤتلف في مخزن تفاعل SAMHD1 الكامل إلى أربعة أضعاف التركيز النهائي المطلوب.

تحضير المنشط أو الركيزة dGTP عن طريق تخفيف المحلول في محلول تفاعل SAMHD1 كامل للوصول إلى تركيز 50 ميكرومولار. إلى الآبار التي تحتوي على التخفيفات المركبة والتحكم في المذيبات فقط ، قم بتوزيع خمسة ميكرولترات من المزيج الرئيسي لبيروفوسفاتيز SAMHD1 ، وإلى آبار عدم التحكم في الإنزيم ، أضف خمسة ميكرولترات من المخزن المؤقت الكامل لتفاعل SAMHD1. ثم قم بتوزيع 10 ميكرولتر من محلول dGDP في جميع الآبار لبدء التفاعل واحتضانه لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

لإيقاف التفاعل ، أضف 20 ميكرولتر محلول إيقاف EDTA. بعد إضافة 10 ميكرولتر من محلول عمل MG إلى جميع الآبار ، امزج المحتوى باستخدام شاكر لوحة microwell المداري وأجهزة الطرد المركزي للوحة عند 1000 × g لمدة دقيقة واحدة. احتضان اللوحة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وقراءة الامتصاص عند 630 نانومتر في قارئ لوحة microwell.

احسب الانحراف المعياري لآبار التحكم الموجبة ثم احسب المتوسط. وبالمثل بالنسبة لآبار التحكم السلبية ، احسب الانحراف المعياري ثم احسب المتوسط. حساب عامل Z هو مؤشر على جودة الفحص.

تطبيع كل قيمة امتصاص إلى القيم المتوسطة للضوابط الإيجابية والسلبية. تعيين عنصر التحكم الإيجابي كنشاط SAMHD1 بنسبة 100٪ والتحكم السلبي كنشاط 0٪ SAMHD1. نشاط SAMHD1 هو دالة لتركيز المركب ويتناسب مع منحنى استجابة جرعة المنحدر المتغير رباعي المعلمات ، مما يسمح بتحديد نصف التركيز المثبط الأقصى للمركب.

قم بتخفيف مخزون النوكليوتيدات التناظري وأكمل المخزن المؤقت لتفاعل SAMHD1 إلى أربعة أضعاف التركيز النهائي وانقل خمسة ميكرولترات إلى الآبار المناسبة للوحة فحص 384 بئرا. لتحضير الإنزيم SAMHD1 أو مزيج بيروفوسفاتيز الرئيسي ، قم بتخفيف بروتين SAMHD1 البشري المؤتلف والإشريكية القولونية بيروفوسفاتيز في محلول تفاعل SAMHD1 الكامل إلى ضعف التركيز النهائي المطلوب. تحضير محلول بيروفوسفاتيز فقط عن طريق تخفيف الإشريكية القولونية بيروفوسفاتيز المؤتلف إلى ضعف التركيز النهائي المطلوب في محلول تفاعل SAMHD1 الكامل.

وبالمثل ، قم بإعداد المنشطات GTP و dGTP alpha S عن طريق تخفيف المخزون في مخزن تفاعل SAMHD1 الكامل إلى أربعة أضعاف التركيز النهائي. الاستغناء عن خمسة ميكرولتر من المنشط ، إما الناتج المحلي الإجمالي أو dGTP alpha S أو المخزن المؤقت الكامل لتفاعل SAMHD1 إلى الآبار المناسبة للوحة فحص 384 بئرا تحتوي على نظائر النوكليوتيدات. ابدأ التفاعل عن طريق توزيع 10 ميكرولتر من المزيج الرئيسي للبيروفوسفاتيز SAMHD1 ، أو بيروفوسفاتيز وحده أو مخزن تفاعل SAMHD1 الكامل في الآبار المناسبة واحتضانه لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد إيقاف التفاعل باستخدام محلول التوقف EDTA ، أضف 10 ميكرولتر من محلول عمل MG إلى جميع الآبار. بمجرد خلط المحتويات ، قم بطرد اللوحة عند 1000 × جم لمدة دقيقة واحدة واحتضانها لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بقياس الامتصاص عند 630 نانومتر.

احسب متوسط قيم الامتصاص لآبار تفاعل pyrophosphatase فقط ، والتي ستكون قيمة الخلفية. ثم اطرح قيمة الخلفية من الآبار المقابلة في تفاعلات SAMHD1 أو pyrophosphatase. أخيرا ، ارسم قيم الامتصاص المصححة لكل نظير نيوكليوتيد مع ظروف GTP و dGTP alpha S العازلة.

في هذه الدراسة ، زادت المادة الماصة مع زيادة تركيز فوسفات الصوديوم بعد الحضانة بكاشف الملكيت الأخضر ووصلت إلى التشبع عند تركيز 0.25 مليمولار. نطاق الكشف الخطي للفوسفات مرئي من 0.004 إلى 0.03 مللي مولار. يتم توضيح متطلبات مكونات الفحص لتحقيق نشاط SAMHD1 القابل للقياس.

لا يمكن ل SAMHD1 ولا pyrophosphatase وحدهما توليد فوسفات عضوي في وجود dGTP. ومع ذلك ، عندما كانت جميع مكونات الفحص موجودة ، لوحظت زيادة في الإشارة. أظهرت منحنيات الاستجابة للجرعة التي تم الحصول عليها لمركبات مثبطات SAMHD1 أن زيادة التركيزات تمنع بشكل فعال نشاط SAMHD1.

لا يمنع هيدروكسي يوريا نشاط SAMHD1 في المختبر ، والذي تم الإشارة إليه من خلال نشاط SAMHD1 غير المتأثر مع زيادة جرعات هيدروكسي يوريا. يقوم ارتباط dGTP بكلا الموقعين الخيفي بتنشيط SAMHD1 ، مما يسمح بالتحلل المائي اللاحق لهذه النيوكليوتيدات ، في حين أن dNTPs الثلاثة الأخرى تتطلب أولا تنشيط GTP للموقع الخيفي الأول قبل أن تتمكن من ربط الموقع الخيفي الثاني ثم يتم تحللها بالماء في الموقع الحفاز. بالنسبة لنظائر النوكليوتيدات ، فإن كلوفارابين ثلاثي الفوسفات هو منشط ثنائي الموقع الخيفي وركيزة حيث لوحظ النشاط في وجود GTP.

في حين أن ثلاثي فوسفات السيتارابين قادر فقط على احتلال الموقع الحفاز حيث أن dGTP alpha S مطلوب لمراقبة النشاط. لم يلاحظ أي نشاط مع جيمسيتابين ثلاثي الفوسفات. بعد تحديد الجزيئات الصغيرة التي تثبط SAMHD1 في هذا الاختبار من خلال الأساليب الفيزيائية ، مثل مقايسات التحول الحراري ، يمكن استخدامها لاستجواب الاشتباك الهدف.

ساعدتنا الطريقة الموضحة هنا على فهم أي من أدوية السرطان يمكن تحلله بواسطة SAMHD1 وتحديد هذا الإنزيم كهدف علاجي محتمل للتغلب على مقاومة الأدوية.