إنتاج بروتينات PRMT المؤتلفة باستخدام نظام ناقلات التعبير عن فيروس باكولو

الهدف العام لهذا البروتوكول هو فحص التعبير عن بناء متعددة من البروتين أرجينين ميثيلترانسفيراس في الإنتاج على نطاق واسع للحصول على كمية ملليغرام من البروتين للدراسات الكيميائية الحيوية والفيزيائية الحيوية والهيكلية في المتوسطة المدعومة، ووضع كفاءة من حيث التكلفة في تغطية التعبير منصة S، baculovirus التعبير نظام ناقلات التعبير. وستقدم الدكتورة ألما سيتوفا الخطوات التالية. تمييع خلايا SF9 المتنامية بشكل كبير إلى كثافة الخلية النهائية البالغة 0.4 مليون لكل ميل في وسائط الحشرات الخالية من المصل ، وتصب في خزان الكاشف العقيم.

استخدام ماصة متعددة القنوات للبرمجة لزرع 0.5 ميل من خلايا SF9 المخففة إلى كل بئر من لوحة 24 جيدا. هذا الحجم يكفي لضمان تغطية حتى من سطح العمل من البئر. وفي الوقت نفسه، فإنه لا يخفف من مزيج العدوى أكثر من اللازم، مما يمكن من كفاءة العدوى.

تسمية بئر واحد من لوحة كخلية فقط، واستخدامه كعنصر تحكم للمقارنة بين الخلية المصابة وغير المصابة لتقييم للعلامات المحتملة للعدوى. احتضان لوحات في 27 درجة حتى الحاجة، ما يقرب من ساعة واحدة، للسماح للخلايا نعلق على لوحات ثقافة الخلية. تمييع كاشف العدوى المختلط جيدا في وسط الحشرات غير المؤتمن وخزان كاشف معقم ، ويخلط بلطف لمدة 10 ثوان.

باستخدام ماصة من 12 قناة، نقل 102 ميكرولتر من كاشف المعاملات المخفف إلى لوحة 96 MicroWell معقمة. نقل 10 ميكرولتر من 0.2 ميكروغرام لكل ميكرولتر من الحمض النووي bacmid المؤتلف في البئر المقابلة من لوحة MicroWell 96 جيدا ومزيج عن طريق اهتزاز بلطف، والتنصت على لوحة من الجانبين. احتضان مزيج العدوى لمدة 15 إلى 20 دقيقة لتشكيل معقد.

باستخدام ماصة قابلة للتعديل من ست قنوات مصممة لنقل بين لوحة 96 و 24 جيدا، تراكب مزيج العدوى على الخلايا قطرة الحكمة في الآبار المقابلة من لوحات العدوى، واحتضان لمدة أربع ساعات في 27 درجة. لضمان توزيع حتى من مزيج transfection على cells'monolayer، صخرة بلطف لوحات ذهابا وإيابا عدة مرات خلال فترة الحضانة. بعد أربع إلى خمس ساعات من وقت العدوى ، أضف 1.5 ميل من وسائط الحشرات الخالية من المصل.

تكملة ذلك مع 10٪ النهائي من مصل البقر الجنيني المعطل للحرارة و 1٪ المضادات الحيوية ومضاد الذهان. احتضان الخلايا في حاضنة 27 درجة لمدة 72 إلى 96 ساعة. هز بلطف لوحات العدوى مرة واحدة في اليوم عندما يكون ذلك ممكنا.

ابحث عن علامات العدوى الواضحة في الخلايا المصابة في 72 إلى 96 ساعة بعد وقت العدوى. بعد أربعة إلى خمسة أيام من العدوى ، يجب أن تكون علامات العدوى واضحة في الخلايا المصابة بالمقارنة مع خلايا التحكم تحت المجهر المقلوب ، ويجب أن تكون الفيروسات الباكولوية المؤتلفة الأولية التي تفرز في وسط زراعة الخلية جاهزة لجمعها. استخدام متعدد القنوات الإلكترونية للبرمجة للسماح في وقت واحد لجمع الفيروسات P1، والعدوى من خلايا SF9 المصنف حديثا في عدوى الخلايا المعلقة في كتل الآبار 24 مع 150 ميكرولتر من الفيروسات P1.

تدور أسفل بقية الأسهم الفيروسية P1 الجماعية لمدة 15 دقيقة، وتغطي كتل البئر 24 مع ثقافة تعليق خلايا SF9 المصابة مع ورقة AirPore. احتضان كتلة البئر 24 في 27 درجة مع اهتزاز في 245 RPMs لمدة 72 إلى 96 ساعة. قبل أربعة أيام من وقت الإنتاج المقرر ، انقسمت خلايا SF9 المتنامية بشكل كبير ، بكثافة الخلية النهائية من 2 مليون لكل ميل إلى خيط اهتزاز زجاجي Erlenmeyer مع حيرات في وسائط الحشرات الخالية من المصل التي تحتوي على 1٪ من المضادات الحيوية النهائية ومضاد الذهان.

هذه الخطوة سوف تولد ثقافة تعليق خلايا الحشرات المصابة وفيروسات P2 في supernatant لعدوى الخلايا الجديدة في دفعة الإنتاج. إضافة الفيروسات P2 المقابلة واحتضان الخلايا المصابة في درجة حرارة أقل من 25 درجة لإبطاء نمو الخلايا، ويهتز في 165 RPMs على شاكر المداري مع ضربة بوصة واحدة. قبل أربعة أيام من وقت الإنتاج المقرر، بذور لترين من خلايا SF9 المتنامية أضعافا مضاعفة في وسائل الإعلام الحرة مصل الحشرات إلى كثافة الخلية من 1 مليون لكل ميل، في قارورة اهتزاز فرنباخ 2.8 لتر.

هز القارورة في 27 درجة مع اهتزاز في 150 RPMs. عالم البحوث آشلي هاتشينسون سوف تظهر البروتوكول التالي. تقسيم أربعة لترات من خلايا SF9 المتنامية أضعافا مضاعفة والوسائط الخالية من مصل الحشرات إلى كثافة الخلية النهائية من 4 ملايين لكل ميل في زجاجات كاشفات خمسة لترات كبيرة.

إضافة 10 إلى 12 ميل من ثقافة تعليق خلايا الحشرات المصابة بالفيروس الكولو. احتضان الثقافة المصابة من خلايا SF9 في شاكر يهز بها 145 دورة في الدقيقة في درجة حرارة أقل من 25 درجة مئوية لمدة 72 إلى 96 ساعة. كميات مليغرام من البروتينات المؤتلفة عدة من عائلة PRMT التعبير في إنتاج فوري baculovirus في خلايا SF9 وتستخدم للدراسات التعليمية البيوكيميائية الحيوية الفيزيائية، كما يمكن أن نرى في الشكل الخامس.

في SGC، تم حل الهياكل البلورية في إيداعها في بنك بيانات البروتين لكامل طول أو أشكال مبتورة من البروتينات PRMT4، 6، 7، و 9 مع التحقيق الكيميائي المختلفة ومثبطات. تم إيداع البلازميدات التعبيرية لهذه PRMTs لإضافة جمع الجينات من قبل SGC وهي متاحة لمجتمع البحوث. في هذا الفيديو، أكدنا على العناصر الرئيسية للفحص الاستكشافي الناجح لبنائهم المتعدد من ميثيل ترانسفيراسيات أرجينين البروتين في الإنتاج على نطاق واسع في نظام التعبير عن الفيروسات الباكولو.

استخدام ماصة متعددة القنوات قابل للتعديل وقابلة للبرمجة العادية ، جعلت العملية برمتها أسرع من الكفاءة. استخدام عالية الأداء وأقل سمية الخلية للخلايا، كاشف العدوى لتوليد الفيروسات المؤتلفة أدى إلى أكثر كفاءة من حيث التكلفة، وهذا البروتوكول معالجة الخلايا transfection. العدوى دفعة واسعة النطاق لإنتاج البروتين مع ثقافة تعليق من فيروس baculo المصابة في ست خلايا خفضت بشكل كبير من المخاض في خطوة تستغرق وقتا طويلا في تضخيم بداية الحيوية.

هو على سبيل المثال، الطرد المركزي هذا مع ثقافة خاصة من الخلايا المصابة. هذا بالطبع في استبعاد التعامل الإضافي مع الخلايا المصابة في تجنب في تشديد في تدهور الفيروس. تعليق ثقافة صيانة الخلية الثقافة في هذا التوسع في الإنتاج في سفينة الثقافة كان حجم حقل عالية تساعدنا على التغلب على الحد من حجم الإنتاج واعتماد منصة واسعة النطاق.

وهذا مفيد للغاية للمختبرات التي لا يمكن الوصول إليها إلى المفاعلات الحيوية أو مساحة محدودة في خط أنابيب الإنتاج. على الرغم من أن تم وصف بروتوكولنا لبروتينات البروتين أرجينين ميثيل ترانسفيراسيس الأسرة، يمكن تطبيق نفس النهج على أي عائلة البروتينات الأخرى التي تتطلب منصة التعبير للحصول على كمية كافية من البروتين للدراسات التعليمية البيوفيزيائية الحيوية الكيميائية.