تعديلات على طريقة Langendorff لعزل المتزامنة من الخلايا العضلية الأذيني والبطيني من الفئران الكبار
مايو 13, 2021
يصف هذا البروتوكول تعديلات طريقة Langendorff بما في ذلك عمق علبة الشريان الأورطي لعزل الخلايا العضلية الأذينية والبطينية المتزامنة من الفئران البالغة.
يمكن أن يساعد هذا البروتوكول على تحسين العائد الأذيني من قلب فأر متغلغل. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أن الخلايا العضلية الأذينية والبطينية يمكن عزلها في وقت واحد تحت نفس حالة الهضم. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لآليات أمراض القلب على المستوى الخلوي ودون الخلوي.
بعد القتل الرحيم لذكر يبلغ من العمر ثمانية إلى 10 أسابيع C57 أسود ستة فأر، استخدم ملقط الأنسجة لرفع جلد xiphoid. ثم باستخدام مقص الأنسجة، وجعل شق الجانبي طفيفة من خلال الجلد. إجراء تشريح حاد بين الجلد واللفافة.
تمديد شق الجلد نحو axillae في شكل V على كلا الجانبين ومواصلة شق من خلال القفص الصدري. ثم باستخدام ملقط الأنسجة، المشبك القص وحرف القفص الصدري صعودا لفضح كامل القلب والرئتين. باستخدام ملقط منحني، قشر قبالة التامور.
إذا كانت الغدة الصعترية تغطي الأوعية العظيمة ، فاستخدم ملقطين منحنيين لتمزيق الغدة الصعترية نحو كلا الجانبين ، ثم اسحب قاعدة القلب برفق نحو الذيل حتى تظهر الشريان الأورطي وشرايين فرعه كوعاء دموي على شكل حرف Y. عبر الشريان الأورطي في الشريان السباتي المشترك الأيسر، ثم قطع الشريان العضدي. استئصال القلب وتزج على الفور في طبق بيتري التي تحتوي على محلول تايرود لغسل وضخ الدم المتبقية.
ثم نقل القلب إلى طبق بيتري آخر يحتوي على حل واحد. تحت مجهر ستيريو، وذلك باستخدام مقص إيريس غرامة، تقليم أي فائض الأنسجة. طرد فقاعات الهواء من الحقنة.
ثم بمساعدة اثنين من ملقط ربط مستقيم، أداء cannulation الأبهري الرجعية، مع الحرص على أن يتم تنفيذ عملية التكعلبة بأكملها تحت سطح السائل. ضبط عمق القنية بحيث غيض القنية في الشريان الأورطي التصاعدي، مع الحرص على عدم اختراق الصمامات الأبهري. ثم مع خياطة ما قبل عقدة 3-O، ligate الشريان الأورطي إلى درجة القنية.
حقن بلطف حل واحد من الحقنة لطرد الدم المتبقي. ثم ربط القلب cannulated إلى جهاز Langendorff، مع الحرص على عدم إدخال أي فقاعات الهواء في القلب. بعد ربط القلب المعلب بجهاز Langendorff ، يتغلغل القلب في الحل الأول لمدة دقيقتين تقريبا.
باستخدام ماصة البولي ايثيلين المعقمة ذات الاستخدام الواحد، رسم حوالي 2.5 ملليلتر من الحل ثلاثة وقبل الحرب عليه في حمام الماء لاستخدامها في وقت لاحق. ثم لهضم الأنسجة، يتغلغل القلب مع الحل المتبقي ثلاثة لمدة 11 إلى 12 دقيقة تقريبا. بعد أول دقيقتين من التشوه باستخدام الحل الثالث، قم بإعادة تدوير المحلول المتغلغل في الخزانات الثاوية بواسطة المضخة العتمة لإعادة استخدامها حتى يتم الانتهاء من الهضم.
عندما يصبح القلب منتفخا ، يتحول شاحبا قليلا ومترهلا ، باستخدام ملقط مسنن ، قرصة عضلة القلب بلطف. إذا كانت بصمة مرئية، وإنهاء الهضم وفصل القلب من الجهاز. لعزل الخلايا العضلية الشريانية البطينية، استخدم ملقط لإزالة البطينين والأتريا ووضعها في أطباق بيتري مختلفة.
ثم أضف الحل قبل تسخينها ثلاثة إلى كلا الطبقين. باستخدام ملقط حاد، triturate الأنسجة في نسيج عكر، ثم ماصة بلطف الأنسجة للهضم حتى دون إدخال فقاعات الهواء. لوقف نشاط الانزيم المتبقية، وذلك باستخدام ماصة، ونقل الأنسجة المهضومة العكر إلى الحل الرابع، ثم الطرد المركزي لمدة 20 ثانية في 192 مرة G.After إزالة supernatant، resuspend رواسب الخلية في الحل الخامس.
لتجنب مفارقة الكالسيوم والكالسيوم الزائد، إعادة إدخال الكالسيوم بطريقة تدريجية بإضافة ما مجموعه 50 ميكرولتر من 100 ملليمولار لكل لتر كلوريد الكالسيوم إلى تعليق الخلية. مرة واحدة وقد أضيفت كل كلوريد الكالسيوم، وتخزين الخلايا في حل تايرود لدراسة المشبك التصحيح. ويرتبط عمق العلبة مع تغلغل الأذينين وملحقاته.
عندما يكون طرف القنية في الشريان الأورطي الصاعد ، يتم تضخيم كلا الزوائد الأذينية مما يشير إلى تغلغل الأذينين الكافي. ومع ذلك ، عندما يكون طرف القنية في الجذر الأبهري ، يتم تزيين كلا الزوائد الأذينية ، مما يشير إلى عدم كفاية التشوه. وكان myocytes الأذينية المعزولة عن طريق التشنج في الشريان الأورطي الصاعد معدلات البقاء على قيد الحياة أعلى من تلك المعزولة عن طريق العلبة في الجذر الأبهري على حد سواء قبل وبعد إعادة إدخال الكالسيوم.
في المقابل، لم يكن هناك فرق في معدلات البقاء على قيد الحياة من الخلايا العضلية البطينية معزولة عن طريق التشنج إما في الشريان الأورطي الصاعد أو الجذر الأبهري قبل وبعد إعادة إدخال الكالسيوم. تسجيل المشبك التصحيح كامل الخلية من تيار الصوديوم في الخلايا العضلية الأذينية البطينية المعزولة، فضلا عن الكثافات الحالية تؤكد أن نوعية الخلايا المعزولة يلبي متطلبات التجارب الكهربية. عند تحويل الشريان الأورطي، تأكد من الاحتفاظ غدة كافية للربط.
خلاف ذلك ، قد تخترق القنية الصمام الأبهري بعد الربط.
نظرة عامة
يصف هذا البروتوكول تعديلات على طريقة لاندغوف لعزلِ الخلايا العضلية الأذينية والبطينية من فئران البالغين في وقت واحد. تعمل هذه الطريقة على تعزيز إنتاج الخلايا العضلية الأذينية مع الحفاظ على جودة الخلايا المعزولة للدراسات الكهربائية الفسيولوجية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- الفيزيولوجيا القلبية الوعائية
- بيولوجيا الخلية
- الكهربية الفسيولوجية
الخلفية
- طريقة لاندغوف هي تقنية مستخدمة على نطاق واسع لري القلب.
- يمكن أن يوفر عزل الخلايا العضلية الأذينية والبطينية في وقت واحد رؤى أفضل حول وظيفة القلب.
- فهم سلوك الخلايا العضلية أمر بالغ الأهمية لدراسة أمراض القلب.
- تحسين إنتاج الخلايا العضلية الأذينية ضروري للحصول على نتائج تجريبية دقيقة.
هدف الدراسة
- لتعزيز إنتاج الخلايا العضلية الأذينية من قلوب الفئران.
- للسماح بعزل الخلايا العضلية الأذينية والبطينية في وقت واحد.
- للتحقيق في الآليات الخلوية الكامنة وراء أمراض القلب.
الطرق المستخدمة
- تم استخدام فئران C57BL/6 البالغة الذكور لإنهاء الحياة لاستخراج القلب.
- تم إجراء قسطرة الأبهر باتجاه الخلف للري.
- تم ري القلوب بمحاليل محددة للهضم.
- تم عزل الخلايا العضلية وتحضيرها للدراسات الكهربائية الفسيولوجية.
النتائج الرئيسية
- أظهرت الخلايا العضلية الأذينية المعزولة باستخدام الطريقة المعدلة معدلات بقاء أعلى.
- لم يؤثر العزل المتزامن على جودة الخلايا العضلية البطينية.
- أكدت التسجيلات الكهربية الفسيولوجية حيوية الخلايا المعزولة.
- كانت عمق القسطرة الأمثل حاسمة للحصول على تروية فعالة للأذين.
الاستنتاجات
- تحسن طريقة لاندغوف المعدلة إنتاج الخلايا العضلية الأذينية.
- يعزز العزل المتزامن قدرات البحث في الفيزيولوجيا القلبية.
- يمكن لهذا البروتوكول تسهيل فهم أفضل لآليات أمراض القلب.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Simultaneous isolation of atrial and ventricular myocytes using a modified Langendorff method addresses a critical bottleneck in cardiac target validation and mechanistic de-risking. This protocol enables high-quality, reproducible cell preparations essential for predictive electrophysiological assays and translational cardiac research. The approach supports robust early discovery and preclinical workflows by ensuring reliable access to both atrial and ventricular cell types from a single preparation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of atrial and ventricular mechanisms in disease-relevant systems.
- Supports functional target validation by providing viable myocytes for mechanistic studies.
- Facilitates predictive confidence in cardiac safety and efficacy assessments.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-viability cardiomyocytes for downstream electrophysiological assays.
- Improves assay reproducibility by controlling for cell source and preparation conditions.
- Enables scalable preparation of both atrial and ventricular cells for compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns cellular models with disease-relevant atrial and ventricular pathologies.
- Ensures continuity from early discovery through preclinical cardiac safety studies.
- Reduces biological risk by validating cell quality for patch clamp and functional assays.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical cardiac research, supporting workflows from hypothesis testing to lead identification and safety de-risking.
- Discovery Biology: Provides robust cellular substrates for mechanistic hypothesis testing and pathway analysis.
- Screening: Supplies reproducible, quantitative readouts for electrophysiological assay development.
- Analytics: Enables direct measurement of sodium currents and cell viability for comparative studies.
- Translational Research: Bridges cellular findings to preclinical cardiac models by ensuring cell quality and relevance.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, reusable protocol for consistent cardiomyocyte isolation across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cardiac research.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of cell isolation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of cardiac programs.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in cardiac dissection and Langendorff perfusion.
- Needs access to specialized perfusion apparatus and patch clamp infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of cannulation and digestion steps.
- Adaptation may be needed for different mouse strains or cardiac disease models.
- Careful control of cannulation depth is critical for optimal atrial cell yield and viability.
