تحليل حجم العقدة الليمفاوية بواسطة التصوير بالموجات فوق الصوتية فائقة التردد في نموذج الفأر المصمم وراثيا Braf/Pten لسرطان الجلد

تتيح طريقتنا مراقبة الزيادة في المشاركة النقيلية للعقد الليمفاوية الإربية عن طريق قياس الزيادة في حجمها. هذه الطريقة غير الغازية جيدة التحمل ، لذلك ، يمكن جدولة جلسات تصوير متعددة على نفس التجربة على مدار أسبوعين. هذه الطريقة مثالية لتقييم تأثير العلاج الدوائي على المرض النقيلي.

لقد طبقنا هذه الطريقة على نموذج الورم الميلانيني Braf / Pten ، ولكن من حيث المبدأ ، يمكن تكييفها لتقييم فعالية الأدوية المختلفة في مجموعة متنوعة من نماذج الفئران قبل السريرية للسرطان النقيلي. وستشارك في هذا الإجراء الدكتورة ماريانا فيتيلو، وهي باحثة ما بعد الدكتوراه من مختبري، والدكتورة كلوديا كوسميك، باحثة زميلة في مؤسسة التمويل الدولية-CNR. لتحريض سرطان الجلد ، ضع ثلاثة ميكرولترات من خمسة ملليمولار 4-هيدروكسي تاموكسيفين على ما يقرب من سنتيمتر مربع واحد من الجلد الحليق في الجزء العلوي من الظهر لمدة ثلاثة أيام متتالية.

بعد ستة أسابيع من طلاء الجلد ، استخدم الفرجار لقياس حجم الورم الأساسي ، وفي النهاية ، من النقائل تحت الجلد. ثم استخدم التصوير بالموجات فوق الصوتية لقياس حجم الغدد الليمفاوية الأربية. بعد تحليل الورم الأولي والغدد الليمفاوية عن طريق الفحص البصري ، قم باستئصالها للدراسات النسيجية.

بعد التأكد من التخدير ، انقل الحيوان إلى لوحة ساخنة في محطة التصوير بالموجات فوق الصوتية فائقة التردد ، مع إبقاء الحيوان في وضع ضعيف. اضبط درجة حرارة اللوحة باستخدام مسبار مستقيمي مشحم بالفازلين للحفاظ على درجة حرارة جسم الماوس في النطاق الفسيولوجي. قم بتغطية الكفوف الأمامية والخلفية بعجينة موصلة وقم بلصقها على أقطاب لوحة ECG المضمنة في اللوحة.

تحقق من الحصول على المعلمات الفسيولوجية وعرضها بشكل صحيح. قم بإزالة الشعر من كلتا المنطقتين الإربيتين عن طريق تطبيق عامل مزيل للشعر وتغطيته بوسط اقتران صوتي. ثم ، قم بتثبيت المسبار الخطي بالموجات فوق الصوتية فائقة التردد في محرك 3D متخصص مدمج في محطة التصوير ، مما يسمح بالحركة الآلية والتدريجية للمسبار.

توجيه وضبط موضع مسبار الموجات فوق الصوتية بشكل صحيح للحصول على صور قصيرة الوصول للعقدة الليمفاوية الأربية ، ووضع المنطقة محل الاهتمام في المنطقة البؤرية. اضبط مسافة المسح الضوئي بين اثنين وخمسة ملليمترات ، وحجم الخطوة على 44 ميكرومتر مع نتيجة من 46 إلى 114 خطوة مسح لكل شريحة عقدة ليمفاوية ، ووقت اكتساب من دقيقة إلى ثلاث دقائق لكل. مسح الحجم الكامل للعقدة الليمفاوية الإربية كسلسلة من الصور 2D B-mode ، والحصول على صور على مستويات متعددة عن طريق الحركة الخطية لمحول الطاقة مع أحجام الخطوات على مقياس ميكرومتر لتوليد بيانات 3D من حيث التنفس وحلقات سينمائية ذات بوابات قلبية.

بعد التصوير ، قم بتخزين الصور المكتسبة رقميا بتنسيق خام لمزيد من التحليلات في وضع عدم الاتصال. بالنسبة لما بعد المعالجة لصور الموجات فوق الصوتية ، افتح مجموعة بيانات صور العقدة الليمفاوية الإربية 3D ، وحدد طريقة متعددة الشرائح واضغط على زر Start (ابدأ) لتصور كل من الإطارات الحالية والصور المصغرة لجميع الإطارات المقابلة لكل صورة تم التقاطها أثناء الاستحواذ على 3D. حدد الصورة المصغرة للإطار الأول حيث تكون العقدة الليمفاوية واضحة لتحميلها في طريقة عرض الكنتوري.

في طريقة عرض الكنتوري ، انقر بزر الماوس الأيسر لإسقاط النقاط على طول حدود العقدة الليمفاوية. بمجرد تعيين العدد المطلوب من النقاط ، قم بلعق الحق لإكمال الكفاف. بعد اكتمال الكفاف الأول، استخدم طريقة عرض الصورة المصغرة لتحديد الصورة التالية للكفاف.

إذا لزم الأمر ، تخطي العديد من الصور بين الخطوط لتقليل عدد الآثار اليدوية اللازمة لكل وحدة تخزين 3D. كرر هذه العملية حتى يتم تحديد وحدة التخزين بأكملها ، ثم انقر فوق إنهاء. أثناء وجودك في مساحة عمل نافذة الوضع 3D ، انقر فوق رمز قياس الحجم أسفل منطقة عرض الصورة لتصور القيمة العددية لحجم العقدة الليمفاوية ، وتنشيط عرض السطح باستخدام العرض ثلاثي الأبعاد لحجم العقدة الليمفاوية.

علاج الفئران مع 4-هيدروكسي تاموكسيفين يحفز نشاط إنزيم CreER ، مما يسبب تحولا على المستوى الجينومي من Braf من النوع البري إلى Braf V600E المتحور ، بينما يتم فقدان Pten. بعد أربعة أسابيع من علاج 4-hydroxytamoxifen ، تصل الأورام الأولية إلى حجم يتراوح بين 50 و 100 ملم مكعب ويمكن قياس نموها بواسطة الفرجار لمدة أسبوعين إضافيين ، وبالتالي تظهر زيادة تدريجية في التصبغ الذي لوحظ في الغدد الليمفاوية الأربية. ترسيب الميلانين ترجع دائما إلى وجود خلايا سرطان الجلد المنتشرة ، كما هو مؤكد من خلال تلطيخ المناعة النسيجية الكيميائية لمستضد سرطان الجلد MelanA و Braf V600E.

في نهاية مرحلة التجزئة ، أظهرت جميع الأقسام تراكب المحيط الخارجي للعقدة الليمفاوية. يتم عرض العروض ثلاثية الأبعاد للعقدة الليمفاوية الإربية اليمنى ، التي تم تحليلها في أربعة وخمسة وستة أسابيع بعد علاج 4-HT هنا. كما تم تحديد الزيادة في حجم الغدد الليمفاوية الإربية اليسرى واليمنى لنفس الحيوان بمرور الوقت.

يوصى بإقران التصوير بالموجات فوق الصوتية مع تلطيخ كيميائي نسيجي مناعي مناسب ، بحيث يتم تأكيد وجود الخلايا السرطانية على المستوى الجزيئي. إلى جانب الغدد الليمفاوية ، يمكن أيضا مراقبة حجم الانبثاث تحت الجلد بمرور الوقت باستخدام التصوير بالموجات فوق الصوتية. إذا كان الإطار الزمني لمدة أسبوعين قصيرا جدا لتقدير آثار الدواء قيد الدراسة ، فحدد موقعا تحريضيا أكثر محيطية أو نمطا وراثيا أقل عرضة للورم.