امتصاص الفلورسنت المسمى Vesicles صغيرة خارج الخلية في المختبر وفي الحبل الشوكي

تصور امتصاص الحويصلات الصغيرة خارج الخلية، والمعروفة أيضا باسم sEVs، من قبل خلايا مختلفة في الحبل الشوكي، يمكن أن تؤكد نجاح تسليم SEVs. وهذا يتيح كل من الدراسات الميكانيكية والعلاجية من sEVs تدار intrathecally من مصادر مختلفة في نماذج roden. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتصور امتصاص الخلايا في الحبل الشوكي الخفيف ، ويمكن أن يساعد في تقييم دور المركبات ذاتية الدفع وجزيئات شحنها في اضطرابات العمود الفقري والألم والالتهاب.

هذا الإجراء سوف يظهر من قبلي، جنبا إلى جنب مع شوان لوه وهو جين تشوتشنغ لين، وهما طالبان دراسات عليا في مختبر الدكتورة سينا أجيت. تبدأ بوضع 18 ملليمتر غطاء زلات في لوحة بئر 12، ثم لوحة العصبية-2a الخلايا في كل بئر مع ما مجموعه 1 ملليلتر من DMEM كاملة تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ القلم العقدية. عندما بلغ عدد الخلايا الطلاقة 80 إلى 90٪ تغيير المتوسطة إلى DMEM exosome المتوسط المنضب في كل بئر إضافة واحدة، 5 أو 10 ميكروغرام من sEVs المسمى.

لمدة ساعة و4 و24 ساعة. للجرعة والوقت تعتمد امتصاص لبقية الآبار في حجم متساو من السيطرة على صبغ. جمع أدمغة الجراء بعد الولادة في 60 ملليمتر، طبق بيتري التي تحتوي على الجليد الباردة هانكس متوازنة محلول الملح تكملها مع 10 hepes ملليمولار، تشريح كل من الفصوص القشرية وإزالة السحايا.

ثم فرم الأنسجة مع شفرة معقمة. نقل الأنسجة إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر تحتوي على بيبان أو deoxyribonucleus عازلة واحدة الفصام واحتضان لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية، يحوم الأنبوب كل 5 دقائق، يستنشق supernatant وإضافة 5 ملليلتر من DMEM كاملة إلى الأنبوب. لتثبيط نشاط الإنزيم، حاول تقييم بعناية لتفكيك الأنسجة مع ماصة مصلية زجاجية 5 ملليلتر، وماصة مرعى مصقولة باللهب.

تمرير تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر، ومن ثم الطرد المركزي الخلايا في 250 مرة G لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، يستنشق المتوسطة ونرى الخلايا في 10 ملليلتر من DMEM كاملة في قارورة 75 سم مربع. بعد 4 ساعات من الطلاء، استبدل الفائقة والمتوسطة مع 15 ملليلتر من المتوسط DMEM الطازجة. بعد 14 يوما في المختبر لفصل microglia وoligodendrocytes، نقل القارورة إلى شاكر المدارية في 320 دورة في الدقيقة لمدة 6 ساعات.

استخدم 5 ملليلترات من إنزيم فص الخلايا لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. لtripsinize، والخلايا الفلكية المتبقية، لتثبيط العمل الأنزيمي، إضافة 5 ملليلتر من DMEM كاملة ومن ثم بيليه الخلايا في 250 مرة G لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. Resuspend الخلايا في DMEM كاملة ونرى الخلايا على 12 ملليمتر رقم 1.5 زلات الغطاء في لوحة بئر 24.

باستخدام برنامج تلفزيوني شطف الخلايا 3 مرات ومن ثم إصلاحها مع 4٪ فورمالديهايد السلطة أو PFA في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. غسل الخلايا الثابتة 3 مرات لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني و permeabilize لهم باستخدام 0.1٪ تريتون X 100 في برنامج تلفزيوني لمدة 10 إلى 15 دقيقة. ثم كرر يغسل مع برنامج تلفزيوني.

استخدام مصل الماعز 5٪ العادي أو NGS في برنامج تلفزيوني لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة لمنع الخلايا، واحتضان الخلايا العصبية-2a مع خريطة الأجسام المضادة في اتجاهين والخلايا الفلكية الأولية مع الأجسام المضادة GFAP بنسبة 1 إلى 500 في الطازجة 5٪ NGS أو PBS بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع اهتزاز لطيف. بعد غسل الخلايا 3 مرات في برنامج تلفزيوني، إضافة الأجسام المضادة الثانوية المترافقة الفلوروفوري في 5٪ NGS. حضانة لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء على الروك.

كرر الغسيل مع برنامج تلفزيوني واحتضان الخلية مع 1 ميكروغرام لكل ملليلتر من DAPI لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. مرة أخرى، غسل الخلايا 3 مرات مع برنامج تلفزيوني. باستخدام وسيط تصاعد المضادة تتلاشى، جبل الغطاء زلات على عدد 1 الشرائح، والسماح لهم الجافة بين عشية وضحاها في الظلام وتخزين الشرائح الزجاجية المعدة في 4 درجات مئوية حتى التصوير على المجهر confocal.

تشريح الحبل الشوكي وإصلاحه في 4٪ PFA في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة. قبل حماية الأنسجة في 30٪ السكروز في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة أو حتى تغرق الأنسجة ومن ثم تخزين الأنسجة في 4 درجات مئوية حتى الكيمياء المناعية، imbed الحبل الشوكي L4 L5 في مجمع أكتوبر، ثم تجميده على الجليد الجاف حتى يتم ترسيخه تماما. استخدام cryostat لقسم الأنسجة في 30 ميكرومتر وجمع المقاطع في لوحة بئر 24 التي تحتوي على برنامج تلفزيوني.

غسل المقاطع 3 مرات لمدة 5 دقائق مع كل 0.3٪ تريتون في برنامج تلفزيوني، منع المواقع ملزمة غير محددة باستخدام 5٪ MGS في 0.3٪ تريتون PBS لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. احتضان الأقسام بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على شاكر. غسل المقاطع 3 مرات لمدة 5 دقائق مع 0.3٪ تريتون في برنامج تلفزيوني.

ثم أضف التركيز المناسب للأجسام المضادة الثانوية. وفقا لمخطوطة النص، احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين، وغسل المقاطع باستخدام برنامج تلفزيوني فقط واحتضانها في 1 ميكروغرام لكل ملليلتر من DAPI لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم كرر يغسل برنامج تلفزيوني تحت المجهر الخفيف، جبل المقاطع على شريحة لاصقة واضحة مع فرشاة الطلاء غرامة.

الرطب زلة الغطاء مع تصاعد المتوسطة وعلاج بين عشية وضحاها في الظلام في درجة حرارة الغرفة، والحصول على الصور تحت المجهر confocal مع الليزر كل منهما، ومتوسط حجم متوسط RA 2 6 4 0.7 sEVs المستمدة كان 140 نانومتر وكان حجم الجسيمات الذروة 121.8 نانومتر. مع الجسيمات الأكثر قابلية للكشف التي تقع ضمن نطاق حجم exosomes أو sEVS. في 50 إلى 150 نانومتر، النشاف الغربي من SEVs، خلية Lysate و exodepleted وسائل الإعلام، أظهرت أن عينات البروتين المشتقة SEV تحتوي على البروتينات علامة SEV أليكس CD81 و GAPDH.

وقد تم إثراء lysate الخلية مع reticulum endoplasmic، والبروتين المقيم كالنكسين وبالتالي كالنكسين بمثابة علامة سلبية للتلوث الخلوي كما كان غائبا في أجهزة الدفع الرباعي. ولوحظ أن امتصاص المركبات الكهربائية ذاتية الدفع يحدث في ساعة واحدة، وبالنسبة لمركبات SEVs 1 و5 و10 ميكروغرام، يمكن اكتشاف مضان ما بعد الحضانة في 4 ساعات، لمدة 4 و5 و10 ميكروغرام من أجهزة التلفاز الخاصة. تم فحص امتصاص PKH 26 sEVs المسمى من قبل الخلايا الفلكية الأولية وتم تناول أقصى مضان من امتصاص SEVS في الخلايا الفلكية القشرية الأولية في 24 ساعة تم تناول SEVs المسمى PKH26 ولوحظ الحد الأقصى للفلورة في 6 ساعات ، بعد الحقن في الخلايا العصبية والخلايا الفلكية الدقيقة.

إدراج الضوابط، sEVs غير المسمى، والسيطرة على صبغ خلق رمز للرياح إشارات إيجابية إيجابية الأخيرة بسبب وضع علامات محددة الآن أوبري الرقص من السواحل التصحيح صبغ غير منضم. ويمكن تأكيد امتصاص المركبات الذاتية من خلال التحقيق في نقل البضائع الجزيئية الحيوية إلى الوصفات والخلايا والأنسجة وتحديد التغيرات في مستويات التعبير عن الجزيئات الحيوية أو الجينات المستهدفة. ويمكن أيضا إجراء دراسات السلوك، للتحقيق في التأثير الوظيفي لتسليم SEV.