حقن ناقلات AAV لعلم البصريات الوراثي في الدماغ الرئيسيات غير البشرية المخدر والمستيقظ

تتضمن العديد من الدراسات العلاجية الجينية والعلمية العصبية حقن ناقلات AAV في أدمغة الرئيسيات غير البشرية. لكي تنجح هذه الدراسات ، يجب أن تكون تقنية الحقن موثوقة. تقنية الحقن لدينا فورية ودقيقة.

يعمل هذا الإجراء بشكل جيد للحقن في الحيوانات المخدرة أو المستيقظة. لدينا قنية محلية الصنع سهلة التعامل معها ومنخفضة التكلفة. سيوضح الإجراء كيفن ماي ، وهو فني هندسي من مختبري.

للبدء ، قم بتخفيف طرف إبرة تحت الجلد بقياس 30 ملم 13 ملم باستخدام مطحنة قرص. ثم ، قطع قطعة من أنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ إلى طول اعتمادا على عمق منطقة الدماغ المستهدفة. باستخدام مطحنة الأقراص ، قم بشطب أحد طرفي الأنبوب المقطوع وقم بتنعيم الطرف الآخر.

Deburr داخل الأنبوب مع بروش. بعد ذلك ، قم بقطع قطعة من أنابيب PTFE إلى طول مناسب لحجم محلول المتجه المراد تحميله. قم بإشعال طرفي الأنبوب عن طريق إدخال إبرة تحت الجلد المخففة.

أدخل الإبرة تحت الجلد المخففة حوالي خمسة ملليمترات في أحد طرفي أنبوب PTFE. ثم أدخل الطرف غير المشطوف من أنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ حوالي خمسة ملليمترات في الطرف الآخر. اختبر القنية عن طريق حقن المياه المصفاة من خلال محور الإبرة تحت الجلد.

تأكد من أن الماء يخرج من طرف أنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ المشطوف بسلاسة وأن الماء لا يتسرب من أي من التقاطعين. بعد اختبار القنية ، ضعها في كيس الأوتوكلاف وقم بتعقيمها عن طريق التعقيم. انقل المحلول المتجه برفق إلى أنبوب PCR معقم باستخدام ماصة P-20 ، مع تجنب تكوين الفقاعة.

بعد ذلك ، قم بإرفاق القنية مع الطرف المشطوف المواجه لأسفل بحامل ستيريوتاكسي موجه رأسيا. ثم قم بتوصيل حقنة قفل luer سعة ملليلتر واحد بمحور الإبرة تحت الجلد في الكانيولا. اغمر الطرف المشطوف في محلول المتجه.

بعد ذلك ، ضع ضغطا سلبيا لطيفا باستخدام حقنة سعة ملليلتر واحد لتحميل المحلول في القنية مع تتبع الغضروف المفصلي بصريا بين المحلول والهواء. بمجرد تحميل محلول المتجه ، استمر في الضغط السلبي اللطيف حتى يصل المحلول إلى محور الإبرة. ثم ، قم بإزالة حقنة المليلتر الواحد وحقن الزيت المعدني الملون ببطء على طول الجدار الداخلي لمحور الإبرة تحت الجلد ، مع الحرص على تجنب فقاعات الهواء.

قم بتوصيل محور الإبرة تحت الجلد بأحد المنفذين المفتوحين لقفل قفل luer ثلاثي الاتجاهات. ثم أغلق المنفذ. املأ حقنة سعة ملليلتر واحد بالهواء وقم بتوصيلها بأي من المنفذين الآخرين.

أخيرا ، أغلق المنفذ المتبقي من السدادة لتوصيل المحقنة بالقنية. إن ربط المحقنة بالهواء في السدادة ، وتحويل هذا الهواء إلى الميناء غير المأهول يمنعه من دفع محلول المتجه مرة أخرى إلى أسفل الكانيولا. ادفع الهواء ببطء من المحقنة إلى الكانيولا.

بمجرد ظهور الزيت الملون عند طرف الإبرة الحادة في أنبوب PTFE ، تحقق من وجود هواء بين المحلول والزيت الملون. استمر في تطبيق الضغط الإيجابي حتى تظهر قطرة من محلول المتجه عند طرف القنية المشطوف. ثم ، أغلق السدادة لمنع المتجه من الخروج من القنية عن طريق الجاذبية.

بمجرد تحميل محلول المتجه ، قم بلصق القنية على المتلاعب المجسم. بعد ذلك ، لتوصيل السدادة بمضخة الهواء الكهربائية ، خذ أنبوب المضخة من المساعد غير المعقم. أمسك بموصل قفل luer من خلال جدار الأكمام المعقمة.

قم بإسقاط طوق الأكمام ، مما يسمح لها بالتمدد على طول الأنبوب عن طريق الجاذبية. بعد ذلك ، قم بتثبيت الإيقاف وربط الأكمام بإحكام حول موصل قفل luer. بعد ذلك ، اختبر مضخة الهواء والقنية عن طريق ضبط مضخة الهواء على ضغط منخفض ، قبل تشغيلها وزيادة الضغط حتى يتقدم الزيت عبر القنية وتظهر قطرة من محلول ناقل عند طرف القنية.

قم بلصق مسطرة بلاستيكية بأنبوب PTFE لقياس حركة الغضروف المفصلي أثناء الحقن. ثم ، قم بقيادة القنية لأسفل باستخدام المتلاعب المجسمة حتى يصل الطرف إلى السطح ويسجل العمق. قم بقيادة القنية إلى أعمق موقع ليتم حقنه على طول المسار.

سوف يغمر السطح عند الاتصال. لتقليل سوء الاستهداف بسبب ضغط الأنسجة ، قم بدفع القنية لأسفل وتجاوز أعمق موقع حقن بمقدار 500 ميكرومتر. ثم ، تراجع ببطء.

البدائل الأخرى هي دفع القنية ببطء أو قيادتها بسرعة والانتظار في القاع لمدة دقيقة إلى خمس دقائق. بمجرد وضع القنية في أعمق موقع حقن ، استخدم مضخة الهواء الكهربائية لحقن 0.5 ميكرولتر من محلول المتجه على مدار 10 إلى 30 ثانية. تأكد من تدفق الحقن عن طريق تتبع الغضروف المفصلي بين الزيت الملون والمحلول المتجه في أنبوب PTFE.

بعد الانتظار لمدة دقيقة واحدة ، اسحب القنية إلى موقع الحقن التالي على طول المسار. بعد الحقن النهائي ، اترك القنية في مكانها لمدة 10 دقائق لتجنب تدفق النواقل. ثم ، قم بسحب القنية وتخلص منها في حاوية حادة للمخاطر البيولوجية.

أنتج حقن ناقلات AAV التي تحمل قناة رودوبسين II المتحولة في كوليكولوس العلوي الأيسر ، متبوعا بالتحفيز بالضوء الأزرق المستمر عند 40 مللي واط ، سلسلة من إمكانات العمل المتتالية. فشلت نبضات الضوء التي تبلغ مدتها مللي ثانية واحدة في استحضار إمكانات الحركة عند 40 مللي واط ، ولكنها استحضرتها بشكل موثوق عند 160 مللي واط. أدى التحفيز البصري للكوليكولوس المتفوق الناجم عن السكاديس الموجهة بصريا إلى تقليل اكتساب الساكيد تدريجيا.

ويتسق بطء هذا التغيير مع اللدونة المستحثة بصريا. توصيل ضوء الليزر الأصفر إلى فيرميس حركي العين بعد حقن AAV في النواة الشبكية tegmentae pontis قمع نشاط الألياف الطحلبية ، وهو مدخلات إلى المخيخ. قلل هذا القمع من نشاط خلية Purkinje ، وهو ناتج من المخيخ.

أثناء القمع البصري الوراثي ، انخفض معدل إطلاق النار وتغير إلى نمط انفجار المسام ، مما يشير إلى أن مدخلات الألياف الطحلبية المثبطة لخلايا Purkinje تؤثر على مرحلة تباطؤ الساكيد عن طريق قيادة الانفجار الثاني. تم التعبير عن قناة رودوبسين حصريا في خلايا Purkinje في فيرميس حركية العين. أدى توصيل نبضات الضوء القصيرة إلى زيادة نشاط السنبلة البسيط لخلية Purkinje المعزولة.

وكثيرا ما أثارت نبضة ضوئية واحدة مدتها 1.5 مللي ثانية أكثر من ارتفاع بسيط واحد. تنشيط السنبلة البسيطة البصرية الوراثية التي تم توقيتها لتحدث أثناء الساكيد زادت من سعة الساكيد ، مما يؤكد الدور المثبط لخلايا Purkinje على مولد انفجار المحرك العيني . يمكن لفقاعات الهواء في القنية أن تعطل الغضروف المفصلي الناقل للنفط ، وتعقد تحديد أحجام الحقن ، وتمنع التحكم الدقيق في معدل التدفق.

لهذه الأسباب ، يعد تحميل المحاليل المتجهة بدون فقاعات هواء أمرا بالغ الأهمية لهذا الإجراء. بعد ستة إلى ثمانية أسابيع من الحقن ، يمكن إجراء التلاعب البصري الوراثي ويمكن معالجة أنسجة المخ للتحليل النسيجي. تسمح هذه التقنية للباحثين باختبار العديد من النواقل في عدد قليل من الحيوانات ، مما يسهل بدوره تطوير ناقلات جديدة والتحقق من صحتها.

وهناك مجال معين من مجالات الاهتمام الحالي يتمثل في تطوير النواقل التي ستستهدف أنواعا محددة من الخلايا العصبية.