اختيار الأجسام النانوية المثبطة المستهدفة بالناقل بواسطة الغشاء الصلب المدعوم (SSM) القائم على الفيزيولوجيا الكهربية

ويستخدم البروتوكول المقدم للفحص عالي الإنتاجية وتحديد الأجسام النانوية المثبطة وغير المثبطة التي تستهدف ناقلات الكهربائية المعاد تشكيلها في البروتيوليبوسومات أو الموجودة في الحويصلات الغشائية. قد يكون تصميم مقايسات النقل صعبا في حالات متعددة، خاصة إذا لم تتوفر الركائز المسماة. إذا كان نفس الكهربية يسمح دراسة تأثير الأجسام النانوية على النقل لأي ناقل كهربائي تقريبا، منذ الفيزيولوجيا الكهربية SSM لا يتطلب الركائز المسمى.

وقد تم التحقيق في الأجسام النانوية لاستخدامها في التطبيقات الطبية. يمكن أن تساعد هذه التقنية في فحص المثبطات المحتملة التي تستهدف ناقلات كهربائية محددة للبشر أو مسببات الأمراض البشرية. للبدء، خذ 10 أنابيب نظيفة ونقل 10 ملليلتر من الغشاء غير النشط المدعوم بالمواد الصلبة، أو SSM، المخزن المؤقت في كل أنبوب.

لإعداد المخازن المؤقتة SSM تنشيط، إضافة الركيزة في الأنابيب باستخدام سلسلة من التركيزات حول التركيز نصف الحد الأقصى المتوقع. بدء تشغيل برنامج SSM والسماح للجهاز تهيئة تلقائيا. تعيين مسار الحفظ للبيانات.

تأكيد عن طريق الضغط على زر موافق. حدد بروتوكول التنظيف الأولي القياسي في خيارات سير العمل وانقر فوق تشغيل. بعد ذلك ، قم بتركيب الشريحة المغلفة بالبروتيوليبوم على المقبس.

تحرك الذراع لقفل رقاقة. أرفق الشريحة المثبتة بالغطاء. حدد CapCom البرنامج في سير العمل، والسماح بتشغيل لتحديد الموصلية والسعة.

تأكد من أن الموصلية أقل من خمسة نانوسيمنس والسعة بين 15 و 35 نانوفاد قبل استخدامه للقياس. نقل حلول التنشيط إلى قوارير ووضع المخازن المؤقتة في العينات التحقيق. نقل العازلة غير النشطة إلى خزان ووضعه بجانب حامل الشريحة في موضع الخزان على اليمين.

إنشاء بروتوكول لسير العمل باستخدام تسلسل تسلسل حل غير نشطة أو تنشيط أو تسلسل BAB في حلقة إجراء ثلاثة قياسات ثم ينتقل إلى المخزن المؤقت تنشيط التالي لكافة المخازن المؤقتة 10. استخدم معدل التدفق الافتراضي 200 ميكرولتر في الثانية مع ثانية واحدة، ثانية واحدة، ثانية واحدة من مرات التدفق لتسلسل BAB وانقر فوق تشغيل لبدء القياس. حفظ البروتوكول والسماح لسير العمل تشغيل عن طريق النقر على زر التشغيل.

ثم إجراء نفس التجربة باستخدام الليبوسومات الخالية من البروتين. استخدم أي برنامج مفضل لتحليل البيانات لرسم الوقت الحالي المقاس واستخدام الدالة لتقدير ذروة الارتفاع في نطاق إضافة المخزن المؤقت المنشط. رسم التيار الذروة ضد تركيز الركيزة لتحديد تأثير نصف الحد الأقصى للتركيز، أو EC50، من الركيزة عن طريق الانحدار غير الخطي.

نقل 50 ملليلتر من المخزن المؤقت SSM غير النشطة في أنبوب نظيف. إضافة الكولين الركيزة إلى تركيز النهائي من خمسة ملليمولار واستخدام هذا لقياس التحكم إيجابية. نقل 10 ملليلتر من المخزن المؤقت SSM غير المنشط إلى أنبوب نظيف.

إضافة الكولين الركيزة إلى خمسة ملليمولار ونانوبودي إلى 500 نانومولار التركيز النهائي. كرر الخطوة لكل نانوبود لإعداد حلول التنشيط كما هو موضح. بدء تشغيل الجهاز SSM وقياس سعة والتوصيلية من رقاقة بروتيوليبوسوم المغلفة، كما هو موضح سابقا.

نقل حل تفعيل دون nanobody في قارورة ووضع المخزن المؤقت في العينات التحقيق. نقل العازلة غير النشطة دون nanobody في خزان ووضعها في أخذ عينات التحقيق. ثم كرر هذه العملية لجميع الحلول التي تحتوي على أجسام نانوية مع تنشيط والحل غير النشط.

إنشاء بروتوكول لسير العمل باستخدام تسلسل BAB. إنشاء حلقة التي تؤدي ثلاثة قياسات لتسلسل BAB باستخدام مخازن عازلة دون الأجسام النانوية، وقياسين لتسلسل BAB مع مخازن تحتوي على جسم نانوي، 120 ثانية حضانة وقت التأخير مع الأجسام النانوية، وثلاثة قياسات لتسلسل BAB مع مخازن تحتوي على نانوبودي. حفظ سير العمل والسماح بتشغيله عن طريق النقر فوق زر التشغيل.

بعد ذلك، قم بإنشاء بروتوكول جديد لسير العمل باستخدام تسلسل BAB وحلقة من خمسة قياسات لغسل جسم النانو المرتبط بعكس اتجاه عكسي. حفظ سير العمل والسماح بتشغيله عن طريق النقر فوق زر التشغيل. قارن آخر تيار ذروة للقياسات مع القياس الأولي للركيزة فقط.

إذا وصل التيار الذروة إلى القيمة الأولية، فقد تم غسلها بنجاح الأجسام النانوية وتم إعادة تأسيس الظروف الأولية. وإلا، كرر سير العمل أو قم بالتغيير إلى شريحة جديدة. كرر هذه العملية باستخدام رقائق فردية لكل شاشة نانوبود، أو كرر مع أجسام نانوية متعددة باستخدام نفس الشريحة.

استخدم أي برنامج مفضل لتحليل البيانات لرسم الوقت الحالي المقاس مقابل الوقت. ثم يقوم البرنامج تلقائيا بتحديد الدالة لتقدير ذروة الارتفاع في نطاق إضافة المخزن المؤقت للتنشيط. تطبيع ذروة التيار ووجود nanobody على أساس قياس الركيزة فقط.

رسم التيارات الذروة في الرسم البياني ومقارنة التيارات الذروة من القياسات الركيزة فقط إلى التيارات الذروة التي تقاس في وجود الأجسام النانوية لتحديد الأجسام النانوية المثبطة. نقل 50 ملليلتر من العازلة SSM غير النشطة في أنبوب نظيف وإضافة الكولين الركيزة إلى تركيز النهائي من خمسة ملليمولار, واستخدام هذا كحل تنشيط للسيطرة الإيجابية. إضافة خمسة ملليلتر من محلول غير نشط لثمانية أنابيب نظيفة, ثم إضافة الكولين الركيزة ونانوبودي المثبطة إلى أنابيب بتركيزات في نطاق IC50 المتوقع.

إضافة 10 ملليلتر من محلول غير نشط إلى ثمانية أنابيب وإضافة نانوبود مثبطة إلى كل أنبوب المقابلة لحاجز عدم النشاط. بدء إعداد SSM وقياس السعة والتوصيلية من رقاقة بروتيوليبوسوم المغلفة. نقل حل تفعيل دون nanobody في قارورة ووضعه في العينات التحقيق.

ثم نقل العازلة غير النشطة دون nanobody في خزان ووضعها في موقف الخزان بجانب حامل رقاقة على اليمين. نقل الحلول التنشيطية وغير النشطة التي تحتوي على أجسام نانوية إلى قوارير ووضع المخازن المؤقتة في عينات المسبار. إنشاء بروتوكول لسير العمل باستخدام تسلسل BAB.

وتشمل حلقة لقياس كل تركيز مرتين، واحتضان لمدة 120 ثانية وقياس ثلاث مرات أخرى. استخدم أي برنامج مفضل لتحليل البيانات لرسم الوقت الحالي المقاس وتحديد الدالة لتقدير ذروة الارتفاع في نطاق إضافة المخزن المؤقت للتنشيط. رسم التيارات الذروة ضد تركيز الأجسام النانوية لتحديد IC50 عن طريق الانحدار غير الخطي.

لتحديد تركيز الركيزة التي ستستخدم أثناء فحص الأجسام النانوية، تم قياس النقل الكهربائي تحت تركيزات ركيزة مختلفة لتحديد EC50. تم اختيار تركيز الركيزة المقابل لظروف التشبع ، خمسة ملليمولار ، وأبقى ثابتا في جميع المخازن المؤقتة المنشطة. تم تصور تأثير الأجسام النانوية المثبطة على النقل الكهربائي من الانخفاض في سعة التيارات الذروة.

بعد تشغيل بروتوكول الغسيل للسماح للأجسام النانوية غير ملزمة ، لوحظ انتعاش من 80 إلى 95 ٪ من ذروة السعة الحالية الأولية. عند التغيير من عدم تنشيط إلى تنشيط الظروف ، لم يتم إدخال تيارات قطع أثرية كبيرة من قبل الأجسام النانوية الموجودة في هذه المخازن المؤقتة. بعد اختيار الأجسام النانوية ذات الخصائص المثبطة ، تم تحديد قيم IC50 للأجسام النانوية الفردية.

من المهم إعطاء الوقت الكافي لمعايرة البروتيوليبوسومات على الشريحة مع العازلة التي تحتوي على الأجسام النانوية. بما أن الربط قابل للعكس ، يجب أن يكون الجسم النانوي موجودا في كل من المخازن المؤقتة النشطة وغير النشطة.