تفعيل وارتقاط السكريات المتعددة القابلة للذوبان باستخدام 1-سيانو-4-ديميثيلامينوبيريدين تترافلوروبورات (CDAP)

السكريات ضعيفة المناعة ما لم ترتبط البروتين وتحتاج إلى تفعيلها لاستخلاص أو اقتران البروتينات. في هذه الطريقة، يستخدم CDAP كموشف شحن الرمل. يقوم CDAP بتنشيط هيدروكسيلات السكريات المتعددة من أجل اشتقاقها أو ربطها بالبروتينات لاستخدامها في اللقاحات أو الكواشف التشخيصية.

وقد حلت CDAP إلى حد كبير محل بروميد السيانوجين ككواشف شحن رملية متعددة الشاريد. CDAP هو أبسط للاستخدام، وأكثر كفاءة، ويمكن استخدامها في درجة الحموضة أقل من بروميد السيانوجين. إنه كاشف تنشيط أفضل بكثير.

يمكن استخدام CDAP مع معظم السكريات ، على عكس الأمينات الاختزالية ، والتي تتطلب هيدروكسيلات محيطية. يمكن استخدام الكيمياء للترافق بشكل مباشر وغير مباشر مع البروتينات ، ويمكن استخدامها لصنع الكواشف التشخيصية. وكان رد فعل تنشيط CDAP، كما هو موضح في الأصل، سريعا جدا ويصعب التحكم فيه.

البروتوكول المقدم هنا يجعل الكيمياء أسهل بكثير لأداء وأكثر من ذلك بكثير استنساخها. قبل البدء في التجربة، ضبط درجة الحموضة من محلول السكريات إلى 9 بإضافة 200 ميكرولتر من محلول مخزون dimethylaminopyridine بطريقة دروبية أثناء التحريك. الحفاظ على رد الفعل المبردة في حمام الماء المثلج لكامل عملية التنشيط.

المضي قدما مع سيانو-dimethylaminopyridine-tetrafluoroborate أو CDAP التنشيط عن طريق نقل 100 ميكرولتر من CDAP إلى محلول البوليساكريد أثناء التحريك. بدء تشغيل جهاز ضبط الوقت ومراقبة تغيير رقم الحموضة أثناء التنشيط بأكمله لمدة 15 دقيقة. الحفاظ على رد الفعل عند درجة الحموضة المستهدفة عن طريق إضافة 10 زيادات ميكرولتر على الفور من هيدروكسيد الصوديوم المولر 0.1.

عند الوصول إلى وقت التنشيط الأمثل، أضف ملليلترين من 0.5 ديهيدرازيد الديهيدراك المولاري في آن واحد إلى البوليساكريد المنشط. تحقق من أن رقم الحموضة في النطاق المطلوب لوظيفية الهيدروكسيد. بعد التحريك المستمر لخليط التفاعل لمدة ساعة واحدة على الأقل ، نقل خليط التفاعل إلى أربع درجات مئوية.

لتقليل تركيز ADH من المنتج، قم بطلب محلول السكريات المشتقة من الزيت الخام باستخدام جهاز غسيل الكلى. استعادة السكريات المشتقة من غسيل الكلى وتحديد تركيز السكريات والهيدرازيد لحساب نسبة الهيدرازيد إلى السكريات. إعداد مليغرام واحد لكل ملليلتر محلول السكريات المتعددة غير المعدلة لاستخدامها كمعيار.

سخني كتلة التدفئة إلى 140 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل لتحقيق درجة حرارة موحدة مستقرة. استخدم وسادة واقية تحت كتلة التدفئة المحيطة بها في حالة انسكاب الحمض. إضافة كميات متفاوتة من مليغرام واحد لكل ملليلتر معيار الكربوهيدرات إلى المسمى 13 في 100 أنابيب اختبار borosilicate في ثلاثية الليكات، وتختص حجم إلى 100 ميكرولتر مع الماء لتحقيق التركيزات القياسية المطلوبة.

وبالمثل، قم بإعداد عينات من المقايسات بإضافة وحدة تخزين تحتوي على خمسة ميكروجرامات من السكرييد المشتق إلى ثلاثة أنابيب عينة. إضافة 100 ميكرولتر من ستة ملليغرام أعدت حديثا لكل resorcinol ملليلتر إلى كل أنبوب. باستخدام ماصة تكرار، إضافة 300 ميكرولتر من حمض الكبريتيك 75٪ المعدة إلى كل أنبوب، دوامة الأنابيب بقوة، مشيرا إلى أنبوب بعيدا، ثم وضع جميع الأنابيب في كتلة سخان بوتيرة ثابتة في ترتيب تسلسلي وتعيين على الفور الموقت لمدة ثلاث دقائق.

في ثلاث دقائق، قم بإزالة الأنابيب بنفس الترتيب ووضعها مباشرة في رف في حمام ماء جليدي. إزالة أنابيب الجليد الباردة للسماح لهم بالتوازن إلى درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. قراءة امتصاص جميع الأنابيب على مطياف الأشعة فوق البنفسجية فيس في 430 نانومتر باستخدام cuvette طول المسار 10 ملليمتر.

لإعداد تفاعلات المقايسة، قم بفرز وترتيب الأنابيب القياسية المسماة في رف الأنبوب من أجل زيادة التركيز. باستخدام micropipette معايرة، إضافة 100 ميكرولتر من المعايير إلى كل أنبوب المقابلة. بالنسبة لمعيار الصفر، استخدم 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعينة.

وبالمثل، إعداد وترتيب أنابيب العينة. ثم باستخدام معايرة 1، 000 ميكرولتر micropipette، إضافة 875 ميكرولتر من العازلة المقايسة لجميع أنابيب المقايسة. لبدء رد فعل المقايسة، أضف 25 ميكرولتر من حمض الكبريتون trinitrobenzene 1٪ إلى كل أنبوب مقايسة بالترتيب المحدد مسبقا في غضون خمس دقائق.

دوامة أنابيب المقايسة لمدة ثانيتين بسرعة عالية، والتأكد من أن دوامات السائل إلى ارتفاع نصف بوصة من فتح أنبوب. تسجيل وقت بدء المقايسة وتعيين جهاز ضبط الوقت إلى ساعتين. ثم ضع رف أنبوب المقايسة في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.

عندما ينتهي الوقت، دوامة الأنابيب والمضي قدما في جمع البيانات. تم فحص ديكتران ADH لdxtran باستخدام المقايسة حمض الكبريتيك ريسورسينول. تم رسم أنبوب قياسي نموذجي يستخدم الجلوكوز كمعيار السكر.

تم تحديد محتوى الهيدرازيد في السكريات المشتقة أو ديكستران باستخدام المقايسة TNBS. تم حساب مستوى الاشتقاق على أنه هيدريد لكل 100 كيلودالتون من الدكستران لتسهيل المقارنة بين البوليمرات من الأوزان الجزيئية المتوسطة المختلفة. قد يحتاج البروتوكول الموضح هنا إلى تكييفه لبوليساكريد محدد.

يمكن استخدام كيمياء CDAP لإضفاء الطابع الوظيفي على السكريات المتعددة للاستخدام مع مجموعة واسعة من الكواشف المقترنة. ويمكن استخدامه، على سبيل المثال، لتعدد السكريات البيوتينيلات للاستخدام في ELISAs. يمكن ربط البروتينات مباشرة بالبوليساكتشاريدات المنشطة من CDAP ، ولكن هذا يتطلب عادة بعض التحسين لبوليساكريد محدد.

يمكن أن يكون العائد اقتران أكثر من 75٪ وقد مكن استخدام الكيمياء CDAP اللقاحات ذات التكلفة المنخفضة اقتران، مثل تلك التي أدلى بها، على سبيل المثال، من قبل معهد المصل في الهند.