تجميع نماذج محاكاة الخلايا المدعومة والموقوفة ثنائية الطبقات لدراسة التفاعلات الجزيئية

يمكن استخدام بناء أغشية ثنائية الطبقة الدهنية الموصوفة في هذا البروتوكول للحصول على معلومات حاسمة حول تفاعلات الأغشية مع العوامل الصيدلانية والمواد السامة البيئية وحتى المركبات البيولوجية. يمكن استخدام هذه التقنيات لتصنيع أغشية متفاوتة التعقيد السائل ، وتقييم نفاذية المركب ، والامتصاص ، والتضمين داخل الأغشية. للبدء، إضافة الحجم المناسب من محلول مخزون الدهون في الزجاج النظيف الخسيس لتحقيق تركيز الحويكل النهائي من 2.5 ملليغرام لكل ملليلتر بعد الإماهة.

إزالة الكلوروفورم من محلول الدهون، وذلك باستخدام تيار من غاز النيتروجين. لضمان إزالة الكلوروفورم بالكامل، قم بتوصيل فيلم الدهون المجفف بالفراغ لمدة أربع ساعات على الأقل. إعادة ترطيب فيلم الدهون المجففة مع حجم المطلوبة من مخزن كلوريد الصوديوم تريس لتسفر عن تركيز الحويكل النهائي من 2.5 ملليغرام لكل ملليلتر، ودوامة لمدة 15 إلى 30 ثانية تقريبا.

نقل تعليق الحويكل في وعاء مع الثلج الجاف حتى المجمدة لمدة 30 دقيقة تقريبا. بعد أن يتم تجميد العينة تماما، إذابة التعليق في حمام مائي 30 إلى 40 درجة مئوية. دوامة تعليق الحويكل المذاب.

لجعل ملليلتر واحد أو أقل من الحويصلات، والحصول على مقذوف مصغرة. قبل الرطب دعم مرشح مع المياه النقية جدا، ثم وضعه على سطح دعم الغشاء داخل حلقة O. كرر لدعم الغشاء الداخلي الثاني.

وضع واحد دعم الغشاء الداخلي في الغلاف الخارجي مقذوف. ضع غشاء بولي كربونات واحد 100 نانومتر على دعم الغشاء الداخلي مباشرة عبر دعم الفلتر. ضع دعم الغشاء الداخلي الثاني في الغلاف الخارجي الخارجي للطارد مع حلقة O وجانب دعم التصفية المواجه لغشاء البولي.

إرفاق البوليتيترافلوروإيثيلين تحمل في عقدة التجنيب والمسمار إغلاقه مع غلاف الخارجي مقذوف. قص البثق في كتلة التدفئة. تحميل تعليق الحويكل الدهني في واحدة من المحاقن ووضع المحاقن في كتلة الحرارة البثق، وإدراج الإبرة تماما في نهاية واحدة من البثق.

أدخل الحقنة الفارغة الثانية في الجانب الآخر واقفل كلا الحقنتين باستخدام مقاطع الذراع على كتلة الحرارة. ادفع تعليق الحويصلة ببطء إلى الحقنة الفارغة ثم عد إلى الحقنة الأصلية. كرر 20 مرة أخرى لما مجموعه 21 يمر عبر غشاء البولي.

نقل الحويصلات الدهنية في كوب نظيف حقير للتخزين. لقذف خمسة إلى 50 ملليلتر من الحويصلات، وتجميع البثق كبيرة عن طريق وضع دعم شاشة ثقب كبير، القرص تركزت، وأقراص استنزاف، وغشاء البولي في الفضاء في دعم أقل البثق. توصيل البثق العلوي والسفلي يدعم باستخدام مسامير الأربعة وتشديد.

إرفاق وحدة البثق إلى اسطوانة عينة عن طريق تنقية إلى أسفل وتشديد مع وجع لتأمين. ملء اسطوانة عينة مع المياه فائقة البور وبث الماء من خلال وحدة البثق قبل إضافة العينة في اسطوانة العينة. إضافة تعليق الحويكل الدهون في اسطوانة عينة والمسمار أعلى مغلقة.

زيادة الضغط ببطء حتى تبدأ العينة بالتنقيط من وحدة البثق بمعدل ما يقرب من 2-3 قطرات في الثانية في خسيس الزجاج النظيف. مرة واحدة وقد تم قذف جميع العينة، إيقاف إمدادات النيتروجين والإفراج عن الضغط في اسطوانة العينة عن طريق فتح صمام تخفيف الضغط ببطء. صب الحويصلات الدهنية مرة أخرى في اسطوانة العينة وتكرار الخطوة السابقة تسع مرات أخرى لما مجموعه 10 البثق.

تحميل تعليق الحويكل في cuvette المناسبة، وإدراجها في أداة تشتت الضوء الديناميكي، وإدخال تفاصيل العينة، وإجراء القياس باستخدام البرامج المرتبطة بها. ضع خلية زيتا في غرفة العينة، وتأكد من اتصال الأقطاب الكهربائية، واغلق غطاء حامل العينة. في البرنامج المرتبط، أدخل تفاصيل العينة وجمع القياسات.

أدخل مستشعر كريستال الكوارتز المرمز بالسيليكا في وحدة التدفق، مما يضمن محاذاة شكل T على البلورة مع شكل T على الوحدة ومسمار وحدة التدفق المغلقة. في الأدوات ذات الغرف المتعددة، يمكن تشكيل طبقات ثنائية إضافية بالتوازي. قم بتوصيل مدخل ومنفذ الأنابيب إلى وحدة تدفق ومضخة.

ضع الأنابيب في الحراس القابضة واغلق غطاء نظام المحلل. ضع حاوية نفايات في منفذ المضخة لجمع الحلول المستهلكة. لإجراء التنظيف، قم بتشغيل المضخة أولا وحدد سرعة التدفق إلى 400 ميكرولتر في الدقيقة.

أدخل أنابيب المدخل في مياه نقية للغاية وانسياب من خمسة إلى عشرة ملليلترات عبر الوحدة. قم بتبديل الأنابيب إلى SDS وانسياب من خمسة إلى 10 ملليلترات من خلال الوحدة. قم بتبديل الأنابيب مرة أخرى إلى مياه نقية للغاية وتدفق 10 إلى 20 ملليلتر من خلال الوحدة.

وأخيرا، تدفق الهواء من خلال وحدة حتى يتم جمع أي حل المتبقية. قم بإزالة المستشعر من وحدة التدفق وشطف المستشعر بالماء النقي للغاية. محرك أجهزة الاستشعار ووحدة تدفق مع تيار غاز النيتروجين، والتأكد من أن القطب يبقى دائما خالية من أي سائل.

في غطاء الدخان الكيميائي، أدخل مستشعر كريستال الكوارتز المغلف بالسيليكا في أداة تنظيف الأشعة فوق البنفسجية أو الأوزون. قم بتشغيل الجهاز واترك العلاج لمدة دقيقتين على الأقل. إزالة أجهزة الاستشعار بعناية وإعادتها إلى وحدة التدفق.

تشغيل أداة محلل لربط البرامج المرتبطة بها وتعيين درجة الحرارة إلى القيمة المطلوبة لتشكيل ثنائي الدهون داعمة. السماح لدرجة الحرارة لتحقيق الاستقرار في الإدخال المطلوب. تكوين القياس والعثور على جميع ترددات الرنين الاستشعار، وتبديد لنغمات ثلاثة وخمسة وسبعة وتسعة و11 و13 قبل بدء القياس.

السماح لكلوريد الصوديوم Tris بالتدفق عبر الوحدة لمدة خمس إلى عشر دقائق، مما يضمن بقاء تغيير تردد خط الأساس أو تغيير Delta F والتبد أو قيم Delta D في السائل مستقرة. وقف المضخة، وإزالة مدخل أنابيب من محلول كلوريد الصوديوم تريس، وإدراجه بعناية في محلول الحويكل الدهون. التدفق الخلفي لمدة خمس ثوان لإزالة أي فقاعات الهواء من أنابيب مدخل، ومن ثم مواصلة تدفق إلى الأمام.

أعد تشغيل القياس في البرنامج إلى صفر خط الأساس. تدفق الحويصلات الدهنية حتى يتم ملاحظة تشكيل طبقة ثنائية في الوقت الحقيقي في برنامج الحصول على البيانات. ثم كرر هذه الخطوة لتغيير أنابيب مدخل من الحويصلات الدهنية مرة أخرى إلى مخزن كلوريد الصوديوم تريس.

إضافة خمسة ميكرولترات من محلول الدهون إلى مقصورة المانحة، وهو ثنائي فلوريد البولي فينيلدين مسامية 96 لوحة مرشح متعددة الشاشات بشكل جيد مع حجم المسام متر 0.45 صغيرة. غمر لوحة التصفية فورا في مقصورة المقبول، وهي لوحة استقبال نقل تحتوي على 300 ميكرولتر من المالحة العازلة بالفوسفات. إضافة 200 ميكرولتر من الفوسفات المالحة المخزنة مؤقتا إلى مقصورة المانحة النقل.

اتبع الخطوات السابقة لوقف المضخة وتغيير أنابيب مدخل إلى حل الحويكل الدهون ومراقبة تشكيل ثنائي الطبقات، ثم تغيير أنابيب مدخل في حل الببتيد ألفا حل الهليكال أو AH. أدخل الحل في وحدة التدفق حتى يتم ملاحظة تغيير التردد وتبديد التغيير من إضافة الحل الجديد. وقف المضخة والسماح للببتيد AH لاحتضان مع الحويصلات لمدة 10 دقائق.

تبديل مدخل الأنابيب إلى كلوريد الصوديوم تريس، وبدء تدفق لإزالة الببتيد AH من الحويصلات تمزق، مما يؤدي إلى تشكيل ناجح من طبقة ثنائية الدهون. أولا، تدفق المذيبات جزيء، ثم، تبديل أنابيب مدخل في الحل الذي يحتوي على جزيء من الفائدة وتدفق لمدة خمس دقائق على الأقل. إذا رغبت في ذلك، وقف تدفق والسماح للسائل الذي يحتوي على جزيء المطلوب لاحتضان مع طبقة ثنائية.

تغيير مدخل أنابيب العودة إلى المذيب جزيء وحدها. تدفق لمدة خمس دقائق على الأقل، ثم تبديل أنابيب مدخل إلى كلوريد الصوديوم تريس، وتدفق لمدة خمس دقائق على الأقل. في البرنامج، أوقف القياس، واحفظ الملف، وتوقف المضخة.

مباشرة بعد الخطوات السابقة لثنائي أحادي الدهون المعلقة أو لثنائية متعددة الدهون مع وقف التنفيذ، وإزالة برنامج تلفزيوني من مقصورة لوحة مرشح المانحة واستبدالها مع 200 ميكرولتر من حل الاختبار. غمر فورا في لوحة استقبال النقل الجديدة مع 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. بعد الحضانة مع هزاز لطيف لمدة ساعتين في 25 درجة مئوية، وجمع 150 ميكرولتر من الحل من مقصورات المانحة والمقبلي.

قياس تركيز الجزيء في كلتا العينتين باستخدام طريقة مناسبة على أساس خصائص هذا الجزيء. تمت مقارنة الحجم والتعددية وإمكانات زيتا من حويصلات PC البيض أحادي الدهون ، واثنين من مؤلفات الحويصلات الدهنية المتعددة. وكان توزيع حجم الحويصلات PC البيض والدهون متعددة الحويصلات واحد متطابقة تقريبا.

واتهم كل من البيض والكمبيوتر متعدد الدهون حويصلات واحدة سلبا، في حين تم شحنها بشكل إيجابي متعدد الدهون اثنين من الحويصلات. أحادي الدهون البيض PC vesicles امتصاصها بسهولة إلى السطح، كما هو مبين من خلال انخفاض في تغيير التردد، وزيادة في تغيير تبديد، تليها تمزق عفوية. حويصلات متعددة الدهون يمتص إلى السطح، ولكن تتطلب إضافة الببتيد AH لتمزق الحويصلات، مما أدى إلى تشكيل ثنائي الطبقة الدهون.

مع ثنائيات الدهون المدعومة ، يمكن تحليل تغيير التردد وتبديد التغيير قبل وبعد إدخال مركب من الفائدة. فعلى سبيل المثال، تم التحقيق في تفاعلات DEHP وسمية بيئية مع uni المدعومة وطبقات متعددة الطبقات. ولوحظت مستويات مماثلة من امتصاص DEHP لكلا النوعين من طبقة الدهون.

ومع ذلك ، لوحظت اختلافات في تغيير التبدد بين الطبقات الثنائية مع تغيير تبديد أكبر شوهد لبيضة PC bilayer مقارنة بالدهون المتعددة ذات الطبقة الثنائية. ولوحظ وجود القليل من التغلغل لكل من أحادي ومتعددة الدهون واحدة من الطبقات الثنائية. بعد هذا الإجراء، يمكن تطوير مجموعة متنوعة من الخلايا التي تحاكي الطبقات ثنائية الدهون لتمكين الفحص الخالي من الخلايا للتفاعلات الجزيئية مع مركبات تتراوح بين المستحضرات الصيدلانية والمواد السامة البيئية.