اختبار تنشيط باسوفيل لتشخيص الحساسية

اختبار تنشيط basophil هو اختبار تشخيصي مجاني في المختبر لتقييم تفاعلات الحساسية بوساطة IgE التي أثبتت أنها مفيدة للتفاعلات التي تسببها الأدوية أو الطعام أو المستنشقات ، وكذلك في بعض أشكال الشرى المزمن. يعتمد هذا الاختبار على تحديد استجابة القاعدية لتنشيط IgE المتقاطع للحساسية أو الدواء من خلال قياس علامات التنشيط عن طريق قياس التدفق الخلوي. يمكن أن يكون اختبار تنشيط الباسوفيل أداة مفيدة وتكميلية لتجنب اختبارات التحدي الخاضعة للرقابة لتأكيد تشخيص الحساسية ، خاصة في الأشخاص الذين يعانون من ردود فعل شديدة تهدد الحياة.

علاوة على ذلك ، يتمتع هذا الاختبار بميزة القدرة على تحليل الاستجابة ضد أي دواء أو مسببات الحساسية مقارنة بالطرق الأخرى في المختبر المتوفرة فقط لعدد قليل من الأدوية والمواد المسببة للحساسية. ترتبط القيود الرئيسية للاختبار بالحساسية غير المثلى ، خاصة في حساسية الدواء. الحاجة إلى إجراء الاختبار لمدة لا تزيد عن 24 ساعة بعد استخراج العينة وعدم وجود توحيد بين المختبرات وخوارزميات التشخيص.

ابدأ بجمع الدم المحيطي في تسعة ملليلتر من أنابيب الهيبارين ، وضع العينات في دوار للحفاظ عليها في درجة حرارة الغرفة حتى تصبح مطلوبة للبروتوكول التجريبي. قم بتسمية أنبوبي مقياس خلوي سعة خمسة ملليلتر لكل منهما للتحكم السلبي والتحكم الإيجابي. قم أيضا بتسمية أنبوب واحد لكل من المواد المسببة للحساسية أو تركيزات الأدوية المختلفة التي يتم اختبارها.

ثم ضع الأنابيب في رف بحيث تتناسب الأنابيب تماما دون الانزلاق. للحصول على أول تحكم إيجابي ، قم بإعداد محلول رباعي الميكرومولار من N-Formylmethionyl-leucyl-phenylalanine أو fMLP في 0.05٪ PBS-T لتأكيد جودة الخلايا القاعدية. للتحكم الإيجابي الثاني ، قم بإعداد 0.05 ملليغرام لكل ملليلتر محلول مضاد ل IgE باستخدام PBS-T.

قم بإعداد مزيج التلوين عن طريق إضافة ميكرولتر واحد لكل من الأجسام المضادة CCR3-APC و CD203c-PE و CD63-FITC لكل 20 ميكرولتر من مخزن التحفيز. ثم أضف 23 ميكرولتر من مزيج التلوين هذا إلى كل أنبوب. أضف 100 ميكرولتر من PBS-T إلى أنابيب التحكم السالبة.

أضف 100 ميكرولتر من fMLP إلى أحد أنابيب التحكم الموجبة وأضف 100 ميكرولتر من مضاد IgE E إلى الآخر إلى بقية الأنابيب. أضف 100 ميكرولتر من تركيزات مختلفة من مسببات الحساسية أو الأدوية واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد الحضانة ، أضف 100 ميكرولتر من الدم إلى كل أنبوب بلطف لتجنب انحلال الدم.

ثم دوامة الأنابيب بلطف واحتضانها لمدة 25 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الحمام الثرموستاتي مع التحريض المتوسط. احتفظ بالأنابيب عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق على الأقل لوقف التحلل. أضف إلى كل أنبوب ملليلتر من محلول التحلل لتحليل كريات الدم الحمراء.

دوامة كل أنبوب ثم احتضان الأنابيب لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب عند 300 غرام عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. ثم اقلب الحامل في الحوض لصب المادة الطافية بينما تبقى الخلايا في قاع الأنابيب.

أضف ثلاثة ملليلتر من PBS-T إلى كل أنبوب لغسل الخلايا ودوامة الأنابيب. قم بإجراء جولة ثانية من الطرد المركزي باستخدام نفس مجموعة المعلمات ، وقم بصب المادة الطافية عن طريق قلب الحامل في الحوض. ثم احتفظ بالعينات عند أربع درجات مئوية محمية من الضوء حتى قياس التدفق الخلوي.

قم بتوصيل مقياس التدفق الخلوي ببرنامج الكمبيوتر وانتظر حتى يصبح مقياس الخلايا جاهزا. قم بتحميل إعدادات القالب والأداة كما هو موضح في مخطوطة النص. ابدأ عملية الحصول على العينة.

لتحديد الخلايا القاعدية المنشطة ، أولا ، قم ببوابة الخلايا الليمفاوية من مخطط التشتت الجانبي للأمام. ثم بوابة الخلايا القاعدية من السكان الليمفاوية كما CCR3 + CD203c + الخلايا والحصول على ما لا يقل عن 500 الخلايا القاعدية لكل أنبوب. اضبط عتبة CD63 على حوالي 2.5٪ باستخدام أنابيب التحكم السلبية وتحليل العينات.

تم التحقيق في تفاعلات فرط الحساسية المعتمدة على IgE عن طريق إجراء اختبار تنشيط basophil ، أو BAT ، باستخدام المواد المسببة للحساسية والعقاقير. تم تحليل حساسية Basophil عن طريق قياس التفاعل عند تركيزات متعددة متناقصة من مسببات الحساسية التي تساعد في تحديد تركيز الحساسية الذي يحفز استجابة 50٪ من الخلايا القاعدية أو EC50. أولا ، تم بوابات الخلايا الليمفاوية من مخطط مبعثر إلى الأمام.

ثم تم بوابات الخلايا القاعدية من مجموعة الخلايا الليمفاوية مثل خلايا CCR3 + CD203c +. ثم تم استخدام مخطط CCR3-CD63 لتحليل تنشيط basophil باستخدام CD63 كعلامة تنشيط لعقارين وتركيزات مختلفة من مسببات الحساسية. يتم إجراء الاختبار بدم كامل جديد ويجب إجراؤه لمدة لا تزيد عن 24 ساعة بعد استخراج الدم.

يجب ألا يتضمن الحافز المستخدم في الاختبار أي سواغ ويجب مراعاة الخصائص الكيميائية للأدوية. طرق إضافية أخرى في المختبر لتشخيص تفاعلات الحساسية بوساطة IgE ، أو تحديد sIgE ، أو اختبار إطلاق الهيستامين.