التصور والتحديد الكمي للإشارات TGFβ/BMP/SMAD تحت ظروف إجهاد القص السائل المختلفة باستخدام القرب-الربط-المقايسة
سبتمبر 14, 2021
هنا، نضع بروتوكولا لتصور وتحليل مجمعات SMAD المتعددة في وقت واحد باستخدام مقايسة ربط القرب (PLA) في الخلايا البطانية المعرضة لظروف إجهاد القص المرضي والفسيولوجي.
يمكن هذا البروتوكول العلماء من مقارنة عدد مجمعات عوامل النسخ كميا في ظل ظروف إجهاد القص المختلفة ، وسيكون مفيدا للأبحاث في بيولوجيا الأوعية الدموية. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هو استخدام قنوات التدفق microfluidic التي تسمح بإجراء تحقيقات في عدة أزواج من الأجسام المضادة ، بما في ذلك الضوابط ذات الصلة في وقت واحد. للبدء، معطف الشريحة قناة ستة بإضافة 0.1٪ الجيلاتين الجلد porcine أعدت في برنامج تلفزيوني في القنوات لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.
إفراغ القنوات من محلول الجيلاتين والبذور Huvecs في الشرائح قبل ترميز ست قنوات في كثافة 2.5 مرات 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر في 30 ميكرولتر من M199 المتوسطة كاملة. السماح للخلايا بالالتصاق لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في الحاضنة الرطبة. إضافة 60 ميكرولتر من M199 حذر مسبقا المتوسطة كاملة إلى كل من الخزانات.
زراعة الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة يومين في حاضنة رطبة مع استبدال متوسط بعد 24 ساعة. جبل أنابيب السيليكون على وحدات السوائل، وملء الخزانات مع ما لا يقل عن 10 ملليلتر من M199 حذر مسبقا المتوسطة كاملة. قم بتوصيل الوحدات السائلة مع الأنابيب بنظام المضخة واجري التشغيل المسبق بدون خلايا لتوازن الوسط وإزالة أي هواء متبقي.
قم بتوصيل القنوات المفردة على شريحة القنوات الست باستخدام أنابيب الاتصال التسلسلي. قم بتوصيل القناة الأولى والأخيرة على الشريحة بالأنابيب المثبتة على وحدة fluidics. لتعرض الخلايا لمستويات عالية من الإجهاد المطلق، وزيادة مجرد خطوة الإجهاد الحكمة مع مراحل التكيف، وتحديد الخطوات في زيادات من خمسة عسر القراءة لكل سنتيمتر مربع في 30 دقيقة.
استخدم الكتل الموجودة على الأنبوب لفصل الشرائح عن المضخات بعد التعرض لإجهاد القص السائل ، وتجنب الانسكاب المتوسط في الحاضنة ، ونقل الشرائح المتدفقة على الجليد. أثناء فصل الأنبوب عن الخزانات، استخدم الإصبع لإغلاق الجانب الآخر من الخزان لتجنب محاصرة فقاعات الهواء في القناة. الحفاظ على تدفق الشريحة على الجليد، يستنشق المتوسط بعناية من الخزانات ولكن ليس من القناة التي تتواجد فيها الخلايا.
غسل العينات مع 90 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني عقيم الباردة عن طريق إضافة برنامج تلفزيوني إلى خزان واحد و يستنشق بعناية من الخزان الآخر، ثم كرر لجميع القنوات. إصلاح الخلايا بإضافة 90 ميكرولتر من محلول PFA المخزنة مؤقتا 4٪ إلى نفس الخزان حيث تمت إضافة برنامج تلفزيوني واستنشاق السائل من الخزان الآخر كما هو موضح. بعد إصلاح الخلايا في جميع القنوات الست، نقل العينات من الجليد إلى درجة حرارة الغرفة، واحتضان لمدة 20 دقيقة.
غسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني عن طريق إضافة برنامج تلفزيوني إلى خزان واحد والحصول عليه بعناية من الخزان الآخر في جميع القنوات، مع الحرص على عدم تجفيف القنوات. إخماد الوصول PFA بإضافة 90 ميكرولتر من كلوريد الأمونيوم 15 ملليمولار المحيطة التي أعدت في برنامج تلفزيوني إلى واحد من الخزانات. يستنشق من الخزان الآخر واحتضان الخلايا لمدة 10 دقائق.
Permeabilize الخلايا عن طريق إضافة 90 ميكرولتر من 0.3٪ تريتون X 100 أعدت في برنامج تلفزيوني في الخزان الفارغ. اسبيرات من الخزان الآخر لكل قناة واحتضان لمدة 10 دقائق، ثم غسلها ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني كما هو موضح من قبل. في 90 ميكرولتر من محلول منع PLA العقيم لخزان واحد.
يستنشق من الجانب الآخر لكل قناة واحتضان لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية في غرفة رطبة. إضافة الأجسام المضادة الأولية في الأجسام المضادة جيش التحرير الشعبى الصينى diluent ودوامة. يستنشق بعناية حل الحجب من الخزانات والقنوات.
أضف 30 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأساسي مباشرة إلى القناة الفارغة عن طريق إمالة الشريحة أثناء إضافة الحل. كرر لجميع القنوات واحتضان في أربع درجات مئوية في غرفة رطبة بين عشية وضحاها أو في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. تمييع ناقص أرنب بالإضافة إلى الماوس PLA تحقيقات 1-5 في الأجسام المضادة جيش التحرير الشعبي المخفف.
غسل جميع القنوات مرتين عن طريق إضافة 90 ميكرولتر من غسل العازلة A وspirating كما هو موضح. بعد قرصنة المخزن المؤقت للغسيل ، أضف 30 ميكرولتر من محلول مسبار PLA واحتضانه في الغرفة الرطبة. تمييع العازلة ربط واحد إلى خمسة في الماء المتأين D وتمييع إنزيم ليغوس 1-40 في العازلة الربط المخفف.
بعد غسل وspirating تماما غسل العازلة A، إضافة 30 ميكرولتر من محلول الربط إلى قنوات فارغة في حين يميل الشريحة، واحتضان في غرفة رطبة. تمييع العازلة تضخيم واحد إلى خمسة في الماء deionized، ثم تمييع إنزيم البوليميراز 1-80 في العازلة التضخيم المخفف على الجليد. بعد غسل واستنشاق تماما العازلة غسل A، إضافة 30 ميكرولتر من محلول تضخيم إلى قنوات فارغة في حين يميل الشريحة، واحتضانه في غرفة رطبة.
تمييع DAPI واحد إلى 500 في غسل العازلة B وغسل جميع القنوات مرة واحدة عن طريق إضافة 90 ميكرولتر من DAPI التي تحتوي على غسل العازلة B، وspirating كما هو موضح لتبخير النوى. ثم غسل جميع القنوات مرة واحدة مع غسل العازلة B دون DAPI. تمييع العازلة غسل B 1-10 في الماء deionized وغسل جميع القنوات مرة واحدة مع 90 ميكرولتر من المخفف غسل العازلة B.After aspirating غسل العازلة B، إضافة على الفور 2-3 قطرات من السائل تصاعد المتوسطة إلى خزان واحد، وإمالة الشريحة لتوزيع المتوسطة المتصاعدة في جميع القنوات.
تخزين العينات في أربع درجات مئوية في بيئة رطبة حتى التصوير. تعرض هوفيكس لضغوط عالية ومنخفضة. زاد إجهاد القص المنخفض من تفاعلات بروتين SMAD في السيتوسول والنوى.
وأظهرت ضوابط الأجسام المضادة واحد لا لإشارات قليلة جدا، مما يثبت نجاح التجربة. أدت زيادة تركيز الأجسام المضادة إلى ارتفاع عدد أحداث جيش التحرير الشعبي لكل خلية ، ولكن تم تقليل الفرق في إشارات جيش التحرير الشعبي بين الخلايا المكشوفة عالية ومنخفضة الإجهاد. يمكن استخدام المخازن المؤقتة ذاتية الصنع للحجب وتمييع الأجسام المضادة كبديل للمخازن المؤقتة التجارية.
وقد اظهر التحديد الكمى لاحداث جيش التحرير الشعبى الصينى للحلول التجارية والحلول ذاتية الصنع للعزل والحجب نفس النمط من اشارات جيش التحرير الشعبى الصينى فى المناطق الخلوية والنووية . ومع ذلك، كان العدد الإجمالي لأحداث جيش التحرير الشعبي لكل خلية أعلى مع الحلول التجارية. تم استخدام مزيج من SMAD Two/Three ، SMAD Four الأجسام المضادة حيث لم يكن الجسم المضاد SMAD Four مناسبا لتجارب الفلورة المناعية.
لم يكن هناك فرق في أحداث جيش التحرير الشعبي في حالة الاختبار مقابل السيطرة ، مما يشير إلى أهمية اختيار تركيبة الأجسام المضادة الصحيحة للكشف عن أحداث جيش التحرير الشعبي. يمكن تكييف البروتوكول الموصوف للكشف عن تفاعلات مجمعات عوامل النسخ المختلفة عن SMADs وبالتالي المساعدة في فهم تنظيم الجينات في ظروف الحماية المعرضة للأثيرو و أثيرو.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يُمكّن هذا البروتوكول من تصور وتحليل مجمعات SMAD المتعددة في الخلايا البطانية تحت ظروف إجهاد القص المتفاوتة. إنه مفيد بشكل خاص للباحثين في بيولوجيا الأوعية الدموية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا الأوعية الدموية
- بيولوجيا الخلية
- الفيزياء الحيوية
الخلفية
- فهم دور مجمعات SMAD في الخلايا البطانية أمر بالغ الأهمية للبحث في الأوعية الدموية.
- إجهاد القص يؤثر على الاستجابات الخلوية ومسارات الإشارة.
- يسمح اختبار الربط القريب (PLA) بالكشف عن تفاعلات البروتينات.
- تعزز تقنية الميكروسوائل الدقة التجريبية.
هدف الدراسة
- لإنشاء بروتوكول لتحليل مجمعات SMAD تحت ظروف إجهاد قص مختلفة.
- لتسهيل المقارنات الكمية لمجمعات عوامل النسخ.
- لتحسين فهم سلوك الخلايا البطانية استجابة لديناميكيات السوائل.
الطرق المستخدمة
- تغليف القنوات الميكروسوائلية بالجيلاتين من جلد الخنزير.
- زرع خلايا Huvecs في شرائح مسبقةً سداسية القنوات.
- حضانة الخلايا لتعزيز الالتصاق.
- استخدام وسط M199 الكامل لصيانة الخلايا.
النتائج الرئيسية
- تصور ناجح لمجمعات SMAD في الخلايا البطانية.
- بيانات كمية عن تفاعلات عوامل النسخ تحت إجهاد القص.
- تبيين فعالية قنوات التدفق الميكروسوائلي.
- رؤى حول الاستجابة الخلوية للظروف الفسيولوجية والمرضية.
الخلاصات
- يوفر البروتوكول طريقة قوية لدراسة تفاعلات البروتينات في الخلايا البطانية.
- يعزز الفهم لبيولوجيا الأوعية الدموية وتأثيرات إجهاد القص.
- يمكن تطبيق هذه النهج في سيناريوهات بحثية مختلفة تتضمن ديناميكيات السوائل.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Quantitative visualization of TGFβ/BMP/SMAD signaling under defined fluid shear stress conditions addresses a critical need for mechanistic de-risking in vascular target validation. This workflow enables precise measurement of transcription factor complex formation, supporting predictive confidence in early discovery and translational vascular research. The approach is directly relevant for portfolio decisions in atherogenesis and vascular pathology programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of TGFβ/BMP pathway activation under physiologically relevant shear stress conditions.
- Supports functional target validation by quantifying SMAD complex formation in endothelial cells.
- Facilitates mechanistic de-risking for vascular disease targets by distinguishing atheroprone and atheroprotective signaling states.
Screening & Assay Development
- Prepares validated endothelial cell systems for downstream screening of pathway modulators.
- Delivers quantitative, reproducible readouts of transcription factor interactions using PLA and fluorescence microscopy.
- Enables simultaneous analysis of multiple antibody pairs and controls within microfluidic flow channels.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro shear stress models with disease-relevant vascular conditions for translational biomarker studies.
- Provides continuity from discovery-stage pathway interrogation to preclinical validation of vascular targets.
- Supports risk-adjusted advancement of candidates targeting TGFβ/BMP signaling in vascular pathologies.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for vascular biology, enabling hypothesis testing, pathway clarification, and quantitative analytics.
- Discovery Biology: Quantifies SMAD complex formation to clarify pathway activation under defined shear stress.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible endothelial systems for compound evaluation.
- Analytics: Generates spatial and quantitative readouts of protein-protein interactions for comparative analysis.
- Translational Research: Models disease-relevant shear stress to inform biomarker and target validation strategies.
- Enterprise Reuse: Adaptable workflow for other transcription factor complexes and signaling pathways in vascular research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in vascular target validation.
- Operational Value: Standardizes and scales quantitative protein interaction assays across multiple conditions.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in vascular programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of vascular targets and candidate advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in endothelial cell culture and microfluidic system operation.
- Needs access to fluorescence microscopy and quantitative image analysis infrastructure.
- Demands rigorous antibody validation and control selection for PLA specificity.
- Adaptable to different transcription factor complexes and fluid shear stress models.
- Performance may vary with antibody combinations and buffer formulations, as shown by control experiments.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:40
Cell Culture and Fluid Shear Stress Exposure
2:55
Fixation
4:58
Blocking and Incubation with Primary Antibody
6:28
Incubation with PLA Probe and Ligation
7:34
Amplification and Mounting
9:14
Results: Effect of Shear Stress on the SMAD Protein Interactions
11:02
Conclusion
