استخدام الطلاء الأساسي ومنظار صغير مثبت مسبقا بعدسة موضوعية لأبحاث الكالسيوم العابرة في الفئران
يونيو 5, 2021
يؤدي انكماش الأسمنت السني أثناء المعالجة إلى إزاحة الصفيحة الأساسية. يقلل هذا البروتوكول من المشكلة عن طريق إنشاء أساس أولي لأسمنت الأسنان يترك مساحة لتدعيم الصفيحة الأساسية. بعد أسابيع ، يمكن تثبيت الصفيحة الأساسية في موضعها على هذه السقالة باستخدام القليل من الأسمنت الجديد ، وبالتالي تقليل الانكماش.
يمكن أن يقلل هذا المنظار المصغر من مشكلة الانكماش مع الأسمنت السني أثناء إجراء الصفيحة الأساسية ويزيد من معدل نجاح تسجيلات المنظار المصغر لإشارات التألق في تكوين طولين. إذا تعذر ملاحظة عابر التألق أثناء الطلاء الأساسي ، فتحقق من تعبير مؤشر الكالسيوم وموقع عدسة التتابع على شريحة الدماغ. ابدأ بتركيب الإبرة الداخلية لقسطرة وريدية قياس 20 بقطر ملليمتر واحد على الذراع المجسم.
خفض القسطرة في الذرة البطنية ammonis 1 في المنطقة المستهدفة. بعد ذلك ، قم بخفض إبرة الحقن المجهري بسرعة 100 إلى 200 ميكرومتر في الدقيقة في القرنية البطنية ammonis 1 ، وضخ 200 نانولتر من الناقل الفيروسي في المنطقة المستهدفة بسرعة 25 نانولتر في الدقيقة. بعد السماح للفيروس بالانتشار لمدة 10 دقائق ، اسحب إبرة الحقن المجهري بسرعة 100 إلى 200 ميكرومتر في الدقيقة.
بعد تطهير عدسة التتابع ، انقع العدسة في محلول ملحي بارد خال من البيروجين حتى الزرع. باستخدام مشبك البلدغ الصغير مع أنبوب الانكماش الحراري ، أمسك عدسة التتابع وضعها أعلى المنطقة المستهدفة بسرعة 100 إلى 200 ميكرومتر في الدقيقة. ثم ، تثبيت العدسة مع الاسمنت الأسنان.
لتعيين منظار صغير ، اربط العدسة الموضوعية في الأسفل وقم بتجميع لوحة القاعدة على المنظار المصغر. لف 10 سم من فيلم البارافين حول الجزء الخارجي من الصفيحة. باستخدام الطين اللاصق القابل لإعادة الاستخدام ، أمسك المنظار الصغير بمسبار الذراع المجسم.
قم بمحاذاة العدسة الشيئية أعلى عدسة الترحيل مع أقل مسافة ممكنة بين العدسات. استخدم الأسمنت السني لتأمين وضع الصفيحة الأساسية ، بحيث يلامس الأسمنت فيلم البارافين فقط. عندما يجف الأسمنت السني ، قم بإزالة فيلم البارافين ، ولوحة القاعدة ، والمنظار الصغير ، مع الحفاظ على قاعدة الأسمنت السني مجوفة.
أغلق عدسة التتابع بمطاط السيليكون المصبوب وقم بتغطية مطاط السيليكون بطبقة رقيقة من أسمنت الأسنان. افصل الماوس عن الأدوات المجسمة وضع الماوس في غرفة الإنعاش. للطلاء الأساسي ، قم بقص الطبقة الرقيقة من سقف الأسمنت السني بعناية باستخدام rongeur العظمي وإزالة مطاط السيليكون.
نظف سطح عدسة التتابع بنسبة 75٪ كحول. اربط المسمار اللولبي بجانب الصفيحة الأساسية لتثبيته في الجزء السفلي من المنظار. اضبط شريحة التركيز البؤري لتكون على بعد 2.7 إلى 3 ملليمترات تقريبا من الهيكل الرئيسي.
عند الانتهاء من الإعداد ، قم بتوصيل miniscope بلوحة الحصول على البيانات وقم بتوصيل miniscope بمنفذ USB 3.0 على جهاز كمبيوتر. قم بتشغيل برنامج الحصول على البيانات الذي طوره فريق جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس. اضبط التعرض إلى 255 ، والكسب إلى 64x ومؤشر LED المثير إلى 5٪ لتوصيل miniscope ببرنامج الحصول على البيانات ، انقر فوق زر الاتصال وشاهد البث المباشر لبرنامج الحصول على البيانات مع الأخذ في الاعتبار هامش عدسة الترحيل كمعلم بارز.
بمجرد العثور على عدسة الترحيل ، قم بمحاذاة عدسة الهدف miniscope مع عدسة الترحيل يدويا. ضبط الزوايا والمسافات المختلفة للمنظار ، ابدأ في البحث عن إشارات مضان. أمسك المنظار الصغير في الموضع الأمثل ، حرك الذراع المجسم نحو المنظار المصغر وألصق المنظار الصغير بالذراع المجسمة بالطين اللاصق القابل لإعادة الاستخدام.
ابحث عن أفضل عرض عن طريق ضبط أذرع X و Y و Z قليلا. اضبط الزاوية بين سطح العدسة الشيئية وعدسة الترحيل عن طريق تدوير قضيب الأذن أو قضيب الأسنان أو الطين اللاصق القابل لإعادة الاستخدام على المحور Z. ينجح التعبير الفيروسي وزرع العدسة عندما تزيح خلية واحدة على الأقل عابرات مضان أثناء الطلاء الأساسي.
ثبت لوحة القاعدة بإحكام بأقل كمية ممكنة من أسمنت الأسنان مع مراقبة المنطقة محل الاهتمام لضمان عدم تغيير الموضع الأمثل. في الدراسة التمثيلية ، أثبت إجراء الطلاء الأساسي الوهمي أنه مفيد لأنه أدى إلى تحول أصغر في موقع الصفيحة الأساسية مقارنة بالإجراء الأصلي. تأثر تحول الصفيحة أيضا بارتفاع الأسمنت السني.
تحولت الصفيحة الأساسية التي كانت مثبتة على ارتفاع 0.5 سم فوق الجمجمة أقل بكثير من الصفيحة الأساسية التي تم تثبيتها على ارتفاع سنتيمتر واحد فوق الجمجمة. في مثال على التصوير الناجح أثناء إجراء الطلاء الأساسي ، لوحظت عابرات مضان جنبا إلى جنب مع الأوعية الدموية في الحيوان المخدر. لوحظت العابرات الفلورية بعد خمسة أيام من الطلاء الأساسي حتى عندما كان الفأر يتصرف بحرية في قفصه المنزلي مع تحول طفيف فقط في الموقف.
تم إجراء تصوير الكالسيوم اللاحق للفئران. في حالات قليلة ، حدثت مشاكل أثناء إجراء الطلاء الأساسي ، مثل عدم وجود أي شيء باستثناء خلفية موحدة أو رؤية هوامش الخلايا البيضاء. دون عابرين مضان.
من المهم تثبيت الصفيحة الأساسية بإحكام على المنطقة المستهدفة بأقل كمية ممكنة من أسمنت الأسنان. باستخدام تقنية الأردواز ، يمكن للباحثين مراقبة النشاط العصبي طوليا عبر هذا. مع الترخيص المناسب ، يمكن تطبيق هذا الإجراء أيضا لمراقبة الشبكة العصبية في مجال الرؤية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
توضح هذه المقالة إجراءً محسنًا لتقليل تقلص الاسمنت الأسنان أثناء عملية تثبيت اللوح الأساسي في إعدادات المينيسكوب. تتضمن الطريقة إنشاء هيكل دعم أسمنت أسنان، مما يسمح بوضع اللوح الأساسي بشكل فعال لاحقًا مع تقليل مشكلات الانكماش، وبالتالي تحسين معدل نجاح تسجيلات إشارات الفلوريسنس.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- علم الأعصاب
- تصوير الفلوريسنس
- تقنيات تسجيل الخلايا العصبية
الخلفية
- يمكن أن يؤدي تقلص الاسمنت الأسنان إلى نزوح الألواح الأساسية في تصوير الفلوريسنس.
- يتم استخدام المينيسكوب لتسجيل إشارات فلوريسنس مؤشر الكالسيوم.
- يهدف البروتوكول إلى تحسين استقرار وضع الغرسة.
- أدت الطرق السابقة إلى تحولات كبيرة في مواقع اللوح الأساسي.
غرض الدراسة
- تطوير طريقة تقلل من النزوح الناجم عن الانكماش في الاسمنت الأسنان.
- تعزيز موثوقية تسجيلات المينيسكوب في أبحاث علم الأعصاب.
- تقييم الآثار المترتبة على ارتفاع اللوح الأساسي على الاستقرار بعد التطبيق.
الطرق المستخدمة
- إعداد المينيسكوب مع هيكل دعم أسمنت أسنان لدعم اللوح الأساسي.
- استهداف القرن الأموني البطني 1 لضخ المتجه الفيروسي.
- تشمل الخطوات الحاسمة التثبيت المنهجي للعدسة الوسيطة وتطبيق الاسمنت الأسنان.
- التحقق من الفلوريسنس أثناء وبعد إجراء اللوح الأساسي لضمان الزرع الناجح.
- تعديل وضع اللوح الأساسي لتحسين عملية التصوير بعد التدخل.
النتائج الرئيسية
- أدت الطريقة الموصوفة إلى تقليل نزوح الألواح الأساسية مقارنة بالتقنيات التقليدية.
- تم تحقيق تصوير ناجح لمؤقتات الفلوريسنس مع استخدام الاسمنت الأسنان بحد أدنى.
- تناقصت استقرارية اللوح الأساسي مع زيادة الارتفاع من الجمجمة.
- تمت ملاحظة التصوير الديناميكي للفلوريسنس حتى في الفئران التي تتصرف بحرية بعد الزرع.
الاستنتاجات
- توضح هذه الدراسة نهجًا محسنًا لتركيبات الميني-سكوب لتحسين نتائج التصوير.
- يعد وضع اللوح الأساسي المستقر أمرًا بالغ الأهمية لتسجيل موثوق بالنشاط العصبي في سياقات البحث.
- تشير النتائج إلى تطبيقات محتملة لتتبع النشاط العصبي في مختلف الأنماط التجريبية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Reliable in vivo calcium imaging in freely behaving mice is critical for translational neuroscience and neuropharma discovery pipelines. This protocol addresses a key technical bottleneck—minimizing misalignment between miniscope lenses due to dental cement shrinkage—thereby improving data quality and reproducibility in longitudinal neural activity studies. Enhanced imaging stability directly supports target validation and mechanistic de-risking in preclinical neurobiology portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust interrogation of neural circuit function in disease-relevant models.
- Reduces technical artifacts, supporting higher predictive confidence in neuronal activity readouts.
- Facilitates functional target validation by ensuring stable, longitudinal imaging conditions.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized workflow for preparing validated imaging systems in freely behaving animals.
- Improves reproducibility and quantitative reliability of fluorescence-based neural assays.
- Supports scalable deployment of miniscopes for compound screening in neuropharmacology.
Translational & Preclinical Research
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting stable, repeated imaging sessions.
- Aligns with translational biomarker strategies by capturing dynamic neural activity in physiologically relevant contexts.
- Reduces risk of data loss or misinterpretation due to technical misalignment.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of discovery biology and preclinical model validation, supporting workflows from early hypothesis testing to lead identification in neuropharma pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of neural circuits by ensuring imaging fidelity.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative fluorescence outputs for compound or genetic perturbation studies.
- Analytics: Enables reliable measurement of calcium transients, facilitating statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Provides stable imaging for longitudinal biomarker studies in freely behaving animal models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized imaging platform for diverse neuroscience R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neural activity studies.
- Operational Value: Standardizes baseplating and imaging procedures, improving reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by reducing technical failure rates and data variability.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurobiological targets and models for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotaxic surgery and in vivo imaging techniques.
- Needs access to miniscopes, data acquisition software, and precise dental cement handling tools.
- Demands cross-team standardization of surgical and imaging protocols for reproducibility.
- Adaptable to various brain regions and genetically encoded indicators with protocol-specific adjustments.
- Dependent on successful viral expression and precise lens placement for optimal results.
