استخدام الطلاء الأساسي ومنظار صغير مثبت مسبقا بعدسة موضوعية لأبحاث الكالسيوم العابرة في الفئران

يمكن أن يقلل هذا المنظار المصغر من مشكلة الانكماش مع الأسمنت السني أثناء إجراء الصفيحة الأساسية ويزيد من معدل نجاح تسجيلات المنظار المصغر لإشارات التألق في تكوين طولين. إذا تعذر ملاحظة عابر التألق أثناء الطلاء الأساسي ، فتحقق من تعبير مؤشر الكالسيوم وموقع عدسة التتابع على شريحة الدماغ. ابدأ بتركيب الإبرة الداخلية لقسطرة وريدية قياس 20 بقطر ملليمتر واحد على الذراع المجسم.

خفض القسطرة في الذرة البطنية ammonis 1 في المنطقة المستهدفة. بعد ذلك ، قم بخفض إبرة الحقن المجهري بسرعة 100 إلى 200 ميكرومتر في الدقيقة في القرنية البطنية ammonis 1 ، وضخ 200 نانولتر من الناقل الفيروسي في المنطقة المستهدفة بسرعة 25 نانولتر في الدقيقة. بعد السماح للفيروس بالانتشار لمدة 10 دقائق ، اسحب إبرة الحقن المجهري بسرعة 100 إلى 200 ميكرومتر في الدقيقة.

بعد تطهير عدسة التتابع ، انقع العدسة في محلول ملحي بارد خال من البيروجين حتى الزرع. باستخدام مشبك البلدغ الصغير مع أنبوب الانكماش الحراري ، أمسك عدسة التتابع وضعها أعلى المنطقة المستهدفة بسرعة 100 إلى 200 ميكرومتر في الدقيقة. ثم ، تثبيت العدسة مع الاسمنت الأسنان.

لتعيين منظار صغير ، اربط العدسة الموضوعية في الأسفل وقم بتجميع لوحة القاعدة على المنظار المصغر. لف 10 سم من فيلم البارافين حول الجزء الخارجي من الصفيحة. باستخدام الطين اللاصق القابل لإعادة الاستخدام ، أمسك المنظار الصغير بمسبار الذراع المجسم.

قم بمحاذاة العدسة الشيئية أعلى عدسة الترحيل مع أقل مسافة ممكنة بين العدسات. استخدم الأسمنت السني لتأمين وضع الصفيحة الأساسية ، بحيث يلامس الأسمنت فيلم البارافين فقط. عندما يجف الأسمنت السني ، قم بإزالة فيلم البارافين ، ولوحة القاعدة ، والمنظار الصغير ، مع الحفاظ على قاعدة الأسمنت السني مجوفة.

أغلق عدسة التتابع بمطاط السيليكون المصبوب وقم بتغطية مطاط السيليكون بطبقة رقيقة من أسمنت الأسنان. افصل الماوس عن الأدوات المجسمة وضع الماوس في غرفة الإنعاش. للطلاء الأساسي ، قم بقص الطبقة الرقيقة من سقف الأسمنت السني بعناية باستخدام rongeur العظمي وإزالة مطاط السيليكون.

نظف سطح عدسة التتابع بنسبة 75٪ كحول. اربط المسمار اللولبي بجانب الصفيحة الأساسية لتثبيته في الجزء السفلي من المنظار. اضبط شريحة التركيز البؤري لتكون على بعد 2.7 إلى 3 ملليمترات تقريبا من الهيكل الرئيسي.

عند الانتهاء من الإعداد ، قم بتوصيل miniscope بلوحة الحصول على البيانات وقم بتوصيل miniscope بمنفذ USB 3.0 على جهاز كمبيوتر. قم بتشغيل برنامج الحصول على البيانات الذي طوره فريق جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس. اضبط التعرض إلى 255 ، والكسب إلى 64x ومؤشر LED المثير إلى 5٪ لتوصيل miniscope ببرنامج الحصول على البيانات ، انقر فوق زر الاتصال وشاهد البث المباشر لبرنامج الحصول على البيانات مع الأخذ في الاعتبار هامش عدسة الترحيل كمعلم بارز.

بمجرد العثور على عدسة الترحيل ، قم بمحاذاة عدسة الهدف miniscope مع عدسة الترحيل يدويا. ضبط الزوايا والمسافات المختلفة للمنظار ، ابدأ في البحث عن إشارات مضان. أمسك المنظار الصغير في الموضع الأمثل ، حرك الذراع المجسم نحو المنظار المصغر وألصق المنظار الصغير بالذراع المجسمة بالطين اللاصق القابل لإعادة الاستخدام.

ابحث عن أفضل عرض عن طريق ضبط أذرع X و Y و Z قليلا. اضبط الزاوية بين سطح العدسة الشيئية وعدسة الترحيل عن طريق تدوير قضيب الأذن أو قضيب الأسنان أو الطين اللاصق القابل لإعادة الاستخدام على المحور Z. ينجح التعبير الفيروسي وزرع العدسة عندما تزيح خلية واحدة على الأقل عابرات مضان أثناء الطلاء الأساسي.

ثبت لوحة القاعدة بإحكام بأقل كمية ممكنة من أسمنت الأسنان مع مراقبة المنطقة محل الاهتمام لضمان عدم تغيير الموضع الأمثل. في الدراسة التمثيلية ، أثبت إجراء الطلاء الأساسي الوهمي أنه مفيد لأنه أدى إلى تحول أصغر في موقع الصفيحة الأساسية مقارنة بالإجراء الأصلي. تأثر تحول الصفيحة أيضا بارتفاع الأسمنت السني.

تحولت الصفيحة الأساسية التي كانت مثبتة على ارتفاع 0.5 سم فوق الجمجمة أقل بكثير من الصفيحة الأساسية التي تم تثبيتها على ارتفاع سنتيمتر واحد فوق الجمجمة. في مثال على التصوير الناجح أثناء إجراء الطلاء الأساسي ، لوحظت عابرات مضان جنبا إلى جنب مع الأوعية الدموية في الحيوان المخدر. لوحظت العابرات الفلورية بعد خمسة أيام من الطلاء الأساسي حتى عندما كان الفأر يتصرف بحرية في قفصه المنزلي مع تحول طفيف فقط في الموقف.

تم إجراء تصوير الكالسيوم اللاحق للفئران. في حالات قليلة ، حدثت مشاكل أثناء إجراء الطلاء الأساسي ، مثل عدم وجود أي شيء باستثناء خلفية موحدة أو رؤية هوامش الخلايا البيضاء. دون عابرين مضان.

من المهم تثبيت الصفيحة الأساسية بإحكام على المنطقة المستهدفة بأقل كمية ممكنة من أسمنت الأسنان. باستخدام تقنية الأردواز ، يمكن للباحثين مراقبة النشاط العصبي طوليا عبر هذا. مع الترخيص المناسب ، يمكن تطبيق هذا الإجراء أيضا لمراقبة الشبكة العصبية في مجال الرؤية.