نموذج محاكاة حيوية ثلاثي الأبعاد في المختبر للورم الأرومي العصبي باستخدام السقالات القائمة على الكولاجين

تسرد هذه الورقة الخطوات المطلوبة لزرع خطوط خلايا الورم الأرومي العصبي على سقالات ثلاثية الأبعاد قائمة على الكولاجين الموصوفة سابقا ، والحفاظ على نمو الخلايا لإطار زمني محدد مسبقا ، واسترداد السقالات للعديد من نمو الخلايا وتحليلات سلوك الخلية والتطبيقات النهائية ، قابلة للتكيف لتلبية مجموعة من الأهداف التجريبية.

يقدم بروتوكولنا نموذجا حيويا 3D يؤثر بشكل وثيق على الأنسجة الأصلية. يمكن استخدام هذا لاكتشاف علاجات ومؤشرات حيوية جديدة لعلاج الورم الأرومي العصبي وتشخيصه. الميزة الرئيسية هي أنه يخلق ظروفا تجريبية أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية لدراسة البيئة المكروية للورم باستخدام تقنية قابلة للتكرار تحقق اتساق دفعة إلى دفعة.

يمكن استخدام طريقة السقالة الخاصة بنا أولا ، لتحديد علاجات جديدة للورم الأرومي العصبي ، وثانيا ، لدمج الخلايا المشتقة من المريض للتنبؤ بشكل أفضل باستجابة المريض الفردية. للبدء ، ضع السقالة المخزنة في PBS في غطاء التدفق الصفحي. استخدم ملاقط معقمة لرفع السقالة برفق من الزاوية ، واضغط على الجدار الجانبي لإزالة PBS الزائد.

ثم ضع السقالة مع توجيه الطبقة اللامعة لأسفل في وسط بئر صفيحة 24 بئرا غير ملتصقة. قم بتسمية اللوحة بتفاصيل خط الخلية وكثافة البذر والنقاط الزمنية. اعمل مع الخلايا ذات كثافة البذر الواحدة في كل مرة ، واحتفظ بالخلايا المتبقية عند 37 درجة مئوية في الحاضنة ، حتى تصبح جاهزة للاستخدام.

بالنسبة لمرفق الخلية في السقالة ، استخدم ماصة P20 ذات أطراف معقمة لخلط تعليق الخلية تماما ، وإضافة 20 ميكرولترا من تعليق الخلية ذي الصلة في وسط كل سقالة ، مما يضمن بقاء تعليق الخلية أعلى السقالة وليس على الجدار الجانبي أو قاعدة البئر. اترك الخلايا تلتصق لمدة ثلاث إلى خمس ساعات عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 95٪ رطوبة. في نهاية الحضانة ، استخدم ماصة P1000 لإضافة ملليلتر واحد ببطء من وسط النمو المسخن مسبقا إلى كل بئر ، ومنع إزاحة السقالات ، واحتضان اللوحة طوال الليل.

راقب السقالات ، في البداية ، كل يومين إلى ثلاثة أيام لمعرفة تغيرات لون وسط النمو حيث تتكاثر الخلايا داخل السقالة. استخدم مسدس ماصة سعة 10 ملليلتر مع وضع بطيء لإزالة وتجاهل ملليلتر واحد من الوسط المستهلك من البئر. عند استخدام الوسط المكيف للتجربة ، اجمع الوسط المستهلك من النسخ البيولوجية في أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر ، وقم بإخراج الحطام الخلوي عن طريق الطرد المركزي.

انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد وقم بتخزين الأنبوب عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر. بعد ضبط مسدس الماصة على وضع التنقيط ، أضف برفق ملليلتر من وسط النمو المسخن مسبقا إلى السقالات. احتضان اللوحة المحتوية على سقالة وتجديد الوسط الطازج طوال فترة النمو المطلوبة ، كما هو موضح.

في غطاء التدفق الصفحي ، قم بتعقيم كاشف فحص صلاحية الخلية المناسب عن طريق الترشيح من خلال مرشح معقم 0.2 ميكرومتر في أنبوب طرد مركزي. سخن المحلول المعقم ، ووسط النمو الكامل ، و PBS المعقم في حمام مائي ، عند 37 درجة مئوية. باستخدام ملاقط معقمة ، انقل السقالات لتحليلها في لوحة جديدة من 24 بئرا ، وقم بتسمية اللوحة بجميع التفاصيل ذات الصلة.

أضف 900 ميكرولتر من وسط النمو المسخن مسبقا إلى كل بئر. ثم أضف 100 ميكرولتر من كاشف صلاحية الخلية المعقمة إلى كل بئر. للتحكم السلبي ، أضف 900 ميكرولتر من المتوسط و 100 ميكرولتر من كاشف صلاحية الخلية المعقمة في بئر بدون سقالة.

استبدل الغطاء الموجود على اللوحة ، وقم بهز اللوحة برفق لمدة ثلاث دقائق تقريبا لتوزيع كاشف صلاحية الخلية المخفف في جميع أنحاء البئر. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 95٪ رطوبة. بعد إزالة اللوحة من الحاضنة ، هز اللوحة برفق لبضع ثوان وقم بإنشاء ثلاث نسخ ، كما هو موضح في المخطوطة النصية.

قم بتوليد النسخ الثلاثية التقنية عن طريق نقل 100 ميكرولتر من الوسط المحتضن والكاشف من بئر واحد من الصفيحة المكونة من 24 بئرا إلى بئر واحد من الصفيحة الشفافة المكونة من 96 بئرا ، وقم بتنفيذ هذه الخطوة ما مجموعه ثلاث مرات لبئر واحد. قم بتغطية اللوحة المكونة من 96 بئرا بورق الألمنيوم لحماية كاشف صلاحية الخلية من الضوء. قم بإزالة وتجاهل 700 ميكرولتر المتبقية من الوسط والكاشف من السقالات في لوحة 24 بئرا.

اغسل كل سقالة مرتين بمليلتر واحد من برنامج تلفزيوني معقم. استخدم قارئ الصفائح الدقيقة لقياس الامتصاص عند 570 و 600 نانومتر ، وحساب النسبة المئوية لتخفيض كواشف صلاحية الخلية وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. تحليل إحصائي لنتائج صلاحية الخلية ، باستخدام البرامج المناسبة.

أدخل القيم الثلاثية البيولوجية لإنتاج أشرطة الخطأ والإشارة إلى تباين الفحص. إجراء تحليل أحادي الاتجاه لاختبار التباين لفحص التغيرات في صلاحية الخلية خلال الإطار الزمني التجريبي باستخدام برنامج الإحصاء الحيوي المناسب. أشر إلى اختلافات كبيرة بين النقاط الزمنية على الرسوم البيانية ، كما هو موضح في مخطوطة النص.

تم تقييم صلاحية خطين من خلايا الورم الأرومي العصبي ، KellyLuc و IMR32 ، نمت على السقالات. أدت زيادة كثافة الخلايا إلى تقليل أكبر في كاشف صلاحية الخلية مع مرور الوقت. تم قياس نمو الخلايا على السقالات بشكل غير مباشر عن طريق تحديد كمية الحمض النووي المستخرج من السقالات ، وتم حساب الخلايا لكل عينة.

أظهرت خلايا IMR32 نموا متزايدا ، ثم خلايا KellyLuc ، مع مرور الوقت. تم تقييم مورفولوجيا النمو وتوزيع الخلايا على السقالات بصريا عن طريق تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوزين والكيمياء المناعية. نمت خلايا KellyCis83 بشكل أسرع وتسللت أعمق في كل من تركيبات السقالة من خط خلايا كيلي الأقل توغلا.

أظهر IMR32 المزروع على نانو هيدروكسيباتيت نمط نمو متناقض مع مجموعات كبيرة مكتظة ، على مدار 14 يوما. تمت مراقبة السمات الخاصة بالخلية عن طريق تلطيخ الكيمياء المناعية ، تليها تلطيخ phalloidin و DAPI ، ولوحظت وفرة الأكتين في خلايا Kelly و KellyCis83 على سقالات الكولاجين والجليكوزامينوجليكان. لتقييم النشاط الخلوي في المختبر ، تم قياس المستويات المفرزة من الكروموجرانين A ، وأنتجت الخلايا المزروعة على سقالات الكولاجين والجليكوزامينوجليكان والكولاجين نانو هيدروكسيباتيت المزيد من الكروموجرانين A مقارنة بالنمو في ثقافة 2D التقليدية.

يفرز خط خلايا KellyCis83 المقاوم للعلاج الكيميائي كروموجرانين أ أكثر من خط خلية كيلي. بعد تعلق الخلية ، يمكن علاج الخلايا بعلاجات مختلفة. هذا من شأنه أن يوفر نتائج أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية لاستجابة الخلايا للأدوية من ثقافة 2D التقليدية.

تسمح هذه التقنية للباحثين باستكشاف أفضل لكيفية تصرف الخلايا السرطانية وتفاعلها مع التحفيز داخل البيئة المكروية للورم ، بدءا من الاستجابة للعلاجات أو التفاعلات مع أنواع الخلايا الأخرى.