في المختبر تقييم إعادة برمجة القلب عن طريق قياس تدفق الكالسيوم القلب محددة مع مراسل GCaMP3
فبراير 22, 2022
نحن نصف هنا، إنشاء وتطبيق TG (Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3)Hze/J (يشار إليه باسم αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 أدناه) خط مراسل الماوس لتقييم إعادة برمجة القلب. يتم تحويل الخلايا الليفية القلبية الوليدية (NCFs) المعزولة عن سلالة الماوس إلى خلايا قلبية مستحثة (iCMs) ، مما يسمح بتقييم مناسب وفعال لكفاءة إعادة البرمجة والنضج الوظيفي ل iCMs عن طريق تدفق الكالسيوم (Ca2+).
ستوفر الطرق الموصوفة في هذا البروتوكول منصة قيمة لتقييم النضج الوظيفي ل ICMs لدراسات إعادة برمجة القلب. يتم مراقبة تدفق الكالسيوم حصريا في ICMs ويوفر طريقة لتقييم النضج الوظيفي ICM. هذه السلالة الماوس يبسط إجراءات التقييم ويعزز استنساخ النتائج.
هذا البروتوكول هو طريقة جديدة لتقييم النضج الوظيفي ICMs في مجال إعادة برمجة القلب. ويمكن أيضا أن تطبق لتقييم التمايز cardiomyocyte ووظيفة القلب. ابدأ بالحصول على ثمانية إلى عشرة جراء، جرو P0 إلى P2 لعزل 10 ملايين من الخلايا الليفية القلبية الوليدية، أو NCFs.
تخدير عميق للجراء عن طريق انخفاض حرارة الجسم. مراقبة قلوب تحت المجهر الفلوري لضمان أن القلب مع النمط الجيني المطلوب يظهر تدفق الكالسيوم، وأشار GCaMP3 مع قلوب ينبض. الأنماط الجينية الأخرى لن تظهر الفلورسينس.
بعد عزلة القلوب، قطعها إلى أربع قطع بحيث تكون متصلة بشكل فضفاض. غسلها جيدا عدة مرات في الجليد الباردة دولبيكو الفوسفات العازلة المالحة، أو DPBS، في لوحة ستة سنتيمتر للحد من تلوث خلايا الدم في الخلايا المعزولة. هضم القلوب مع ثمانية ملليلتر من الحارة 0.25٪ تريبسين-EDTA في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
تجاهل التريبسين الفائق وإضافة خمسة ملليلتر من 0.5 ملليغرام لكل ملليلتر نوع دافئ اثنين collagenase في محلول الملح المتوازن هانك. دوامة الخليط جيدا واحتضانها في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد الحضانة، مرة أخرى، دوامة الخليط جيدا والسماح للأنسجة غير المهضومة يستقر بالجاذبية.
جمع supernatant في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر مع خمسة ملليلتر من المتوسطة الليفية الباردة. تمييع الخلايا مع متوسطة الخلايا الليفية بحيث كثافة البذر حوالي في 2-2.5 مرات 10 إلى الخلايا الرابعة لكل سنتيمتر مكعب. ثم بذر الخلايا في أطباق أو لوحات.
يجب أن يكون للخلايا الليفية المرفقة شكل بيضاوي إلى مستدير في اليوم الثاني بعد البذر. في اليوم صفر، بذور NCFs إلى كثافة حوالي 1-2 مرات 10 إلى الخلايا الرابعة لكل سنتيمتر مكعب في وسط الخلايا الليفية. في يوم واحدة يستبدل واحدة الثقافة وسط مع فيروس يحتوي وسط لكل جيدا بما أن يشد.
في اليوم الثاني، بعد 24 ساعة من الإصابة بالفيروس، استبدل الفيروس الذي يحتوي على وسيط بوسط ICM منتظم. تقييم تدفق أيونات الكالسيوم مع مجهر مضان مقلوب في درجة حرارة الغرفة. مراقبة الخلايا الإيجابية GCaMP3 تحت الهدف 10X، وضمان أنه يظهر الخلايا العفوية الضرب في قناة برايتفيلد.
وأظهرت قلوب مع النمط الجيني الصحيح تدفق أيون الكالسيوم متزامنة مع الضرب، تصور كما flourescence GCaMP3. في حين لم يلاحظ أي مضان في قلوب السيطرة. NCFs معزولة تعلق على البئر في غضون ساعتين وأظهرت شكل بيضاوي إلى مستدير بعد يوم واحد من البذر.
أظهر تذبذب أيون الكالسيوم تغيرا في الفلورية GCaMP3 بين الحد الأقصى والحد الأدنى وتغير تذبذب أيون الكالسيوم في مثل هذه الخلايا بشكل دوري. بعد إدخال IMAP ، كان عدد مجموعات الضرب أعلى بكثير من ذلك في المجموعة الخاضعة للرقابة حيث تم زيادة عدد الخلايا الإيجابية GCaMP3 مع تدفق أيونات الكالسيوم لحقل عالي الطاقة في المجموعة المعالجة المتوسطة IMAP. يجب أن تكون NCFs معدة حديثا وصحية بعد العزلة.
يمكن أن يساعد الإجراء السريع لعزل القلب والقطع ووقت الهضم المناسب على تجنب الحد من صلاحية الخلايا وحالتها. توفر هذه الطريقة طريقة لتحديد ICMs الناضجة وظيفيا للباحثين في إعادة برمجة القلب. مع العديد من أساليب التقييم الأخرى ، يمكن للمرء الحصول على فهم أكثر إيجازا حول ICMs الناضجة وظيفية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تستعرض هذه المقالة سلالة فأر مراسلة جديدة، αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3، لتقييم إعادة البرمجة القلبية. يسمح البروتوكول المعتمد بتقييم الخلايا العضلية القلبية المستحثة (iCMs) المشتقة من الخلايا الليفية القلبية لحديثي الولادة (NCFs) من خلال تحليل تدفق الكالسيوم.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- إعادة برمجة القلب
- الخلايا العضلية القلبية المستحثة
- تحليل تدفق الكالسيوم
الخلفية العلمية
- يسهل نموذج الفأر αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 إجراء أبحاث القلب.
- يمكن تحويل الخلايا الليفية القلبية حديثة الولادة بكفاءة إلى iCMs.
- يعمل تدفق الكالسيوم كمؤشر رئيسي للنضج الوظيفي لـ iCM.
- تعزز هذه الطريقة من إمكانية تكرار النتائج في دراسات إعادة برمجة القلب.
الغرض من الدراسة
- تأسيس منصة موثوقة لتقييم النضج الوظيفي للخلايا العضلية القلبية المستحثة (iCM).
- تبسيط إجراءات التقييم في أبحاث إعادة برمجة القلب.
- تقديم رؤى حول تمايز الخلايا العضلية القلبية ووظائف القلب.
الطرق المستخدمة
- عزل الخلايا الليفية القلبية حديثة الولادة من الجراء في المراحل من P0 إلى P2.
- تحويل الخلايا الليفية القلبية حديثة الولادة (NCFs) إلى خلايا عضلة قلبية مستحثة.
- تقييم النضج الوظيفي عبر قياس تدفق الكالسيوم.
- تقييم كفاءة إعادة البرمجة ووظائف القلب.
النتائج الرئيسية
- تحويل ناجح للخلايا الليفية القلبية (NCFs) إلى خلايا عضلية قلبية مستحثة (iCMs) وظيفية.
- يشير تدفق الكالسيوم الملاحظ حصرياً في iCMs إلى النضج.
- تعزيز إمكانية تكرار النتائج في دراسات إعادة برمجة القلب.
- بروتوكول قابل للتطبيق لتقييم تمايز الخلايا العضلية القلبية.
الاستنتاجات
- يعتبر نموذج الفئران αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 أداة قيمة.
- يعد تحليل تدفق الكالسيوم فعالاً لتقييم نضج الخلايا العضلية القلبية المستحثة (iCM).
- يمكن لهذه الطريقة أن تعزز الأبحاث في مجال إعادة برمجة القلب ووظائفه.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
لا يزال تقييم النضج الوظيفي للخلايا القلبية المستحثة يمثل عقبة حرجة في عملية إعادة برمجة القلب للعلاجات التجديدية. يوفر هذا البروتوكول قراءة مباشرة تعتمد على المراسل لتدفق الكالسيوم، مما يتيح تقييماً موضوعياً للنضج الوظيفي لخلايا iCM، ويدعم التحقق من الأهداف والحد من المخاطر الميكانيكية في مراحل الاكتشاف المبكرة. ومن خلال ربط إعادة البرمجة النسخية بالمخرجات الكهرومغناطيسية الوظيفية، فإنه يعزز الثقة التنبؤية في النماذج قبل السريرية ويوجه قرارات المحفظة المتعلقة باستراتيجيات إصلاح القلب.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: يتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال ربط إيصال عامل النسخ (MGT) بقراءات عابرة للكالسيوم الوظيفية في الخلايا المعاد برمجمتها.
- القيمة التشغيلية: يستخدم تألق GCaMP3 لعزل الخلايا العضلية القلبية المستحثة (iCMs) المعاد برمجمتها بنجاح، مما يقلل الاعتماد على المؤشرات غير المباشرة مثل التعبير الجيني.
- القيمة التنبؤية: يعمل تدفق الكالسيوم كمؤشر حيوي وظيفي يدعم تقليل المخاطر البيولوجية وتعزيز الثقة في الأهداف ضمن نهج إعادة برمجة القلب.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: تؤسس منصة قياسية تعتمد على الفلورة لقياس تدفق الكالسيوم كمتغير تابع كمي في مقاييس نضج خلايا iCM.
- قابليّة التكرار: يضمن خط الفئران المراس (reporter mouse line) الكشف المتسق عن خلايا iCM الوظيفية عبر التجارب، مما يدعم توحيد المقايسة.
- قابليّة التوسع: متوافقة مع المجهر الفلوري وقابلة للتكيف مع أنظمة التصوير عالية الإنتاجية لفحص كفاءة إعادة البرمجة.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الأهمية المرضية: يوفر نظاماً ذا صلة بالمرض لتقييم النضج الوظيفي لخلايا iCM في المختبر، مما يربط بين مرحلة الاكتشاف والتحقق من الصحة في الدراسات قبل السريرية.
- الاستمرارية الترجمية: يتيح التقييم الطولي لنضج خلايا iCM بدءاً من مراحل إعادة البرمجة المبكرة وصولاً إلى الكفاءة الكهروفيزيولوجية الوظيفية.
- تقليل المخاطر الميكانيكية: تساعد قياسات تدفق الكالسيوم في التمييز بين الخلايا التي تمت إعادة برمجتها هيكلياً وخلايا iCM الناضجة وظيفياً، مما يقلل من النتائج الإيجابية الكاذبة.
تكامل مسار العمل وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن تسلسل عملية الاكتشاف، بدءاً من التحقق من الهدف، مروراً بتحديد المركبات الرائدة، وصولاً إلى التقييم قبل السريري، وهي تتيح تحديداً إجراء التقييم الوظيفي بعد إعادة البرمجة النسخية ولكن قبل التحقق في الجسم الحي (in vivo).
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات من خلال تحديد ما إذا كانت عوامل إعادة البرمجة تحفز ليس فقط التعبير عن المؤشرات، بل وأيضاً التعامل الوظيفي مع الكالسيوم.
- الفحص: توفر أنظمة بيولوجية قابلة للتكرار وجاهزة للمقايسة، مع قراءات كمية لتدفق الكالسيوم لمقارنة المركبات أو الظروف.
- التحليلات: تولد بيانات زمنية قائمة على الفلورة حول تردد وسعة تذبذب الكالسيوم، مما يتيح المقارنة الإحصائية لظروف إعادة البرمجة.
- الأبحاث الانتقالية: تربط نتائج إعادة البرمجة في المختبر (in vitro) بالأنماط الظاهرية الوظيفية للخلايا العضلية القلبية ذات الصلة بالنماذج قبل السريرية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة مراسل قابلة لإعادة الاستخدام، يمكن تطبيقها عبر أهداف متعددة لإعادة برمجة القلب وبروتوكولات تمايز متنوعة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: يوفر قياساً مباشراً للنضج الوظيفي، مما يقلل من الغموض الميكانيكي في نتائج إعادة البرمجة.
- القيمة التشغيلية: يعزز التوحيد القياسي وقابلية التكرار من خلال خصوصية المراسل الجيني، مما يقلل من التباين الناتج عن الطرق المعتمدة على الأجسام المضادة.
- القيمة الاستراتيجية: يحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال ربط إعادة البرمجة الجزيئية بالجاهزية الكهرومغناطيسية الوظيفية.
- تأثير المحفظة: يتيح تحديد أولويات استراتيجيات إعادة البرمجة بناءً على المخاطر المعدلة، وذلك استناداً إلى عائد iCM الوظيفي وجودة النضج.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في تربية الفئران، وعزل أنسجة القلب، والمجهر الفلوري.
- يعتمد على توفر سلالة الفئران αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 وأنظمة التوصيل الفيروسي لـ MGT.
- يستلزم ظروف استزراع وتوقيتاً موحدين لضمان اتساق تحريض iCM وتقييم تدفق الكالسيوم.
- قد يتطلب التكيف مع مصادر بديلة للأرومات الليفية أو أنواع أخرى التحقق من خصوصية المراسل ودقة إشارات الكالسيوم.
- تشمل القيود العملية الاعتماد على الانقباض التلقائي لتصور التدفق والاحتمالية المتغيرة في كفاءة عفن التحول (transfection).
الأسئلة الشائعة حول الأدوية الحيوية
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:53
Isolation and Selection of Neonatal Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 Mice Hearts
1:23
Isolation of Neonatal Cardiac Fibroblasts (NCFs)
2:43
Reprogramming NCFs to iCMs with MGT Encoding Retrovirus Infection
3:28
Results: In Vitro Assessment of Cardiac Reprogramming
4:20
Conclusion
