نشر AAV لبنيات التعبير القائمة على المحسن في الجسم الحي في دماغ الفأر
مارس 31, 2022
يصف هذا البروتوكول مقايسة مراسل محسن عابر جديد قائم على rAAV. يمكن استخدام هذا الفحص للحث على التعبير المدفوع بالمحسن في الجسم الحي في دماغ الفأر.
هذا البروتوكول مهم لأنه يتيح تصور ليس فقط ما إذا كان تسلسل المحسن يمكن أن يقود التعبير ولكن حيث يمكن أن يدفع التعبير في جزء معين من الجسم. إنه سريع. تستغرق الحقن أقل من 10 دقائق لإكمالها ، ويمكن رؤية ما إذا كان يتم التعبير عن جين المراسل وأين يمكن رؤيته في غضون أيام قليلة من جمع العينة.
لبدء الاستنساخ ، اختر أو صمم بنية مراسل. يضع البناء المستخدم هنا المرشح المحسن في المنطقة الثلاثة الرئيسية غير المترجمة لجين مراسل EGFP المعبر عنه تحت سيطرة المروج الأدنى hsp68. لتصميم بادئات PCR لتضخيم تسلسل الاهتمام والاستنساخ في المتجه ، أضف ذراع التماثل المناسب لاستنساخ جيبسون إلى الطرف الأولي الخمسة من البادئات.
باستخدام الاشعال المصممة ، قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل من عينة الحمض النووي. اهضم من واحد إلى 10 ميكروغرام من الحمض النووي المتجه باستخدام Pac1 و Asc1 ، اعتمادا على العدد المطلوب من تفاعلات الاستنساخ المطلوبة. من خلال استخدام 0.7 إلى 1٪ هلام الكهربائي لمدة 30 إلى 60 دقيقة عند 100 فولت ، افصل شظايا هضم التقييد.
استخرج الشريط الخاص بالناقل الخطي ، وقم بتنقيته باستخدام مجموعة استخراج الجل التجارية. بمجرد اكتمال استنساخ جيبسون وتحويل الخلايا ، قم بطلاء الخلايا على وسائط انتقائية ، واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية. بعد التحقق من الاستنساخ الناجح لبناء المراسل ، قم بتلقيح خمسة ملليلتر من ثقافة البداية باستخدام مخزون الجلسرين.
قم بتنمية الثقافة لمدة ثماني إلى 16 ساعة في حاضنة اهتزاز عند 30 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة. عندما يتحول المرق إلى غائم ، قم بتخفيف ثقافة البداية 1،000x في 250 إلى 300 ملليلتر من مرق LB الانتقائي الطازج ، واحتضنها طوال الليل في حاضنة تهتز عند 30 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة. باستخدام مجموعة ماكسي البلازميد التجارية ، قم بتنقية البلازميد.
لاختبار إعادة تركيب لوائح الاتصالات الدولية ، قم بإجراء عملية هضم Xma1. تصور العصابات. تأكد من أن الملخص الخاص بك يظهر العدد المتوقع من النطاقات.
ستؤدي إعادة التركيب إلى نطاقات أقل من المتوقع. تحضير خليط AAV المؤتلف للتسليم. عند مقارنة أنماط التعبير لفيروسات مراسل محسن متعددة ، قم بتخفيف كل فيروس لمساواة عيار الفيروس بالفيروس الأقل تركيزا.
امزج فيروس المراسل المحسن وفيروس المراسل الضابط المعبر عنه بشكل أساسي بنسبة اثنين إلى واحد أو ثلاثة إلى واحد. أضف كمية صغيرة من الصبغة الخضراء السريعة بتركيز نهائي 0.06٪ كسر طرف ماصة زجاجية مسحوبة مصنوعة من أنبوب شعري مدرج بالميكرولتر عن طريق ثقبه برفق في مناديل دقيقة وخالية من النسالة. أدخل الماصة في مجموعة شفاط باستخدام جهاز تطبيق الضغط المتصل بحشية مطاطية لحمل ماصة microcapillary.
ارسم حجما صغيرا من حوالي 0.2 إلى 0.5 ميكرولتر من الزيت المعدني في الماصة عن طريق تطبيق ضغط سلبي من خلال الشفاط. احتفظ بمجموعة الشافطة جانبا ، وضع الفيروس على الثلج حتى يصبح جاهزا للحقن. بعد التخدير بالتبريد للفئران حديثي الولادة ، استخدم ضغطا سلبيا باستخدام مجموعة الشافطة ، وارسم خليط الفيروس في الماصة الزجاجية المسحوبة حتى يتجاوز الغضروف المفصلي علامة القراد التي تبلغ سعتها ميكرولتر.
خذ الماوس بعيدا عن الغرفة الباردة ، وضعه على سطح الطاولة. حدد موقع مواقع الحقن الثنائية في منتصف الطريق بين لامدا وبريغما ، وكذلك الخيط السهمي وكل عين. قم بتعقيمها باستخدام مناديل كحولية.
بيرس جمجمة الفئران حديثي الولادة باستخدام ماصة الزجاج المسحوبة. عندما تدخل الإبرة إلى الجمجمة ، ضع ضغطا إيجابيا من خلال مجموعة الشفاط. الاستغناء عن ميكرولتر واحد من الفيروس في البطين الجانبي ، وسحب ماصة.
ضع الماوس على وسادة التدفئة أو غرفة التدفئة للتعافي. أعد الحيوان إلى قفص المنزل بمجرد استيقاظه. سجل صور مضان تنقل قسم الدماغ باستخدام عدسة ذاتية منخفضة التكبير 5x.
من خلال تحديد موقع الحقن ، قم بتقييم مدى نقل الفيروس ، اعتمادا على كثافة وشدة خلايا الفلورسنت الحمراء. قارن بين الحيوانات التي تم تحويلها بالمثل. سجل صورا فلورية باستخدام عدسة موضوعية تكبير أعلى تزيد عن 25 ضعفا.
بعد ذلك ، افتح برنامج التحليل ، وقم بتطبيق مرشح متوسط ثلاثة في ثلاثة لتقليل الضوضاء. انقر فوق قائمة العملية ، ثم انقر فوق الضوضاء ، واختر خيار Despeckle. بعد ذلك ، لطرح مضان الخلفية من الصور ، ابدأ بفصل قنوات صورة متعددة القنوات.
انقر فوق قائمة الصورة ، ثم انقر فوق اللون ، وحدد الخيار تقسيم القنوات. باستخدام أداة تحديد المستطيل أو الدائرة، ارسم شكلا صغيرا في مساحة من الصورة بدون أي خلايا فلورية. قم بقياس متوسط كثافة البكسل للخلفية بالنقر فوق تحليل ثم قياس ، وكرر العينة عدة مرات.
متوسط القيمة الرمادية من خمس إلى ثماني مناطق خلفية ، وإسقاط القيم العشرية. اطرح القيم من كل بكسل في الصورة عن طريق تحديد قائمة العملية، ثم انقر على الرياضيات والطرح. بعد ذلك ، أدخل قيمة الخلفية المراد طرحها ، وانقر فوق موافق. إذا لزم الأمر ، قم بدمج القنوات مرة أخرى في صورة متعددة القنوات عن طريق تحديد قائمة الصورة ، ثم انقر فوق اللون ، وحدد دمج القنوات.
لحساب عدد خلايا الفلورسنت الخضراء ، قم بإخفاء القناة الخضراء ، وارسم شكلا حول منطقة الدماغ يعبر عن التألق الأحمر باستخدام أداة التحديد الحر. انقر فوق وظيفة القياس لقياس المساحة والكثافة المتكاملة ومتوسط القيمة الرمادية للقناة الحمراء في المنطقة المحددة. احسب عدد الخلايا الخضراء باستخدام أداة تحديد متعددة النقاط ، وقم بتطبيع عدد الخلايا الخضراء حسب الكثافة المتكاملة للقناة الحمراء.
بعد تحويل مراسل المحسن أن الفأر الذي تم حقنه داخل الجمجمة في P0 مع بنية AAV إيجابية أظهر تعبير EGFP مدفوعا بالمحسن في الطبقات السفلية الوسطى من القشرة بعد 28 يوما من الحقن. لا يظهر الفأر الذي تم حقنه ببنية تحكم سلبية عند P0 أي تعبير عن EGFP بعد 28 يوما من الحقن ، مما يدل على أن عناصر المحسن موجودة لدفع نسخ EGFP في دماغ الفأر. لتصور المنطقة التي تم تحويلها بنجاح والتحكم في التباين المحتمل ، تم فحص مكتبات مراسل محسن تم تسليمها بواسطة AAV من عيارات مختلفة.
تقود مكتبة العيار العالي للمحسنات المرشحة تعبير EGFP الواسع بينما تقود مكتبة العيار السفلي للمحسنات المرشحة تعبير CGFP المتناثر في دماغ الماوس P7. من الضروري مزج مراسل المحسن AAV مع التحكم الإيجابي في كل حقنة من أجل التمييز بين المعززات بدون نشاط وعمليات التسليم الفاشلة. يمكن إقران هذا الإجراء بالكيمياء المناعية أو RNA FISH أو تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لتحديد أنواع الخلايا التي ينشط فيها المحسن.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة مقايسة محسّنة جديدة قائمة على rAAV مؤقتة للاستخدام داخل الجسم الحي في دماغ الفأر لتصور التعبير الجيني المدفوع بالمحسّن. يتيح البروتوكول للباحثين تقييم ما إذا كان المحسّن يمكنه دفع التعبير أو أين يمكنه القيام بذلك داخل مناطق معينة من الدماغ.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- التعبير الجيني
- البيولوجيا الجزيئية
الخلفية
- فهم تسلسلات المحسّن أمر حاسم لفك شفرة تنظيم الجينات.
- توفر نماذج داخل الجسم الحي رؤى حول أنماط التعبير في أنسجة معينة.
- تتيح هذه الطريقة تقييمًا سريعًا لنشاط الجين مقارنة بالأساليب التقليدية.
هدف الدراسة
- إنشاء مقايسة فعالة لتصور نشاط المحسّن في كائن حي.
- تسهيل التقييم السريع للتعبير الجيني المبلغ عنه في دماغ الفأر.
- تمكين تحديد موقع دقيق للتعبير المدفوع بالمحسّن.
الأساليب المستخدمة
- يستخدم البروتوكول نهج نقل قائم على rAAV.
- تُستخدم نماذج دماغ الفأر لتقييم أنماط التعبير بعد التسليم الفيروسي.
- تشمل الخطوات الرئيسية استنساخ بنى المبلغ وتنفيذ الحقن داخل الجسم الحي.
- يحدث تحليل أنماط التعبير الجيني بعد أيام من الحقن.
النتائج الرئيسية
- تصور ناجح للتعبير الجيني المدفوع بالمحسّن EGFP في طبقات قشرية معينة.
- تمييز واضح بين تأثيرات بنى التحكم الإيجابية والسلبية.
- يشير التحقق من أنماط التعبير إلى تقييم فعال لنشاط المحسّن.
الاستنتاجات
- يُظهر هذا البروتوكول طريقة جديدة لتقييم وظيفة المحسّن داخل الجسم الحي.
- يُمكّن من التقييم السريع والمركز لتعبير الجينات، مما يعزز فهمنا للآليات التنظيمية.
- النهج قيم للدراسات المستقبلية التي تستكشف تنظيم الجينات في السياقات العصبية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
This protocol enables rapid, in vivo assessment of enhancer activity in the mouse brain, providing spatial and temporal resolution of gene regulation without requiring transgenic models. It supports target validation by linking non-coding DNA elements to functional expression patterns in disease-relevant neural circuits. The approach accelerates mechanistic de-risking in early discovery by delivering quantitative, imaging-based readouts of enhancer function.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by testing whether candidate enhancer sequences can drive gene expression in specific brain regions.
- Operational Value: Uses standard cloning and AAV packaging to generate enhancer-reporter libraries for high-throughput screening of regulatory elements.
- Predictive Value: Enables biological de-risking by linking enhancer activity to cell-type-specific expression patterns in the cortex and other neural structures.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces quantitative fluorescence readouts (EGFP intensity) that correlate with enhancer strength and activity patterns across developmental stages.
- Operational Value: Leverages expanding AAV serotypes and standardized imaging workflows for reproducible, scalable enhancer testing across multiple constructs.
- Assay Readiness: Generates validated biological systems (transduced mouse brain) suitable for downstream applications like immunohistochemistry or single-cell RNA sequencing to define enhancer-active cell types.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by mapping enhancer activity to specific cortical layers and developmental timepoints (P0 to P7).
- Translational Continuity: Enables cross-functional collaboration by providing standardized, spatially resolved expression data that can inform biomarker alignment and target selection.
- Risk-Adjusted Advancement: Facilitates go/no-go decisions by distinguishing active enhancers from negative controls through normalized green-to-red fluorescence ratios.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, enabling hypothesis testing of non-coding regulatory elements prior to lead identification and preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by visualizing where enhancers drive expression in the mouse brain, linking genotype to phenotype in neural tissue.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized virus production, equitized titers, and co-injection with control reporters to distinguish true enhancer activity from delivery failure.
- Analytics: Enables quantitative comparison of enhancer activity via integrated density measurements and background-subtracted fluorescence imaging.
- Translational Research: Connects to preclinical work by allowing follow-up with RNA FISH or immunohistochemistry to determine cell-type specificity of enhancer-driven expression.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for enhancer library screening, leveraging low-cost AAV production and standard microscopy for repeated campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in enhancer function through direct in vivo visualization.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via controlled virus titers, background subtraction protocols, and normalized cell counting.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid screening of enhancer candidates without generating and maintaining transgenic lines.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing clear, imaging-based evidence of enhancer activity in disease-relevant brain regions.
Implementation Considerations
- Requires molecular cloning expertise for Gibson assembly and viral vector preparation.
- Depends on AAV purification and titration infrastructure for consistent enhancer-reporter delivery.
- Necessitates stereotaxic injection skills and neonatal mouse handling for accurate intracranial delivery.
- Relies on fluorescence microscopy and image analysis tools (e.g., background subtraction, channel splitting) for reliable readout.
- Limited by enhancer context-dependency; activity may vary across developmental stages, brain regions, or disease models.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:39
Enhancer Candidate Sequence Cloning into the AAV Vector Plasmid
3:09
Intracranially Inject rAAV-Packaged Plasmid into Neonatal Mice
5:32
Image and Analyze Brain Tissue Sections for Enhancer Activity
8:10
Results: AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs in Mouse Brain
9:21
Conclusion
